رنگ آمیزی در میکروب شناسی

یکی از مشخصات مهم باکتری ها که به شناسایی آنها کمک می کند. رنگ پذیری آنها با رنگ های مختلفی است که برای این منظور به کار می روند.اولین گام در شناسایی باکتری‌ها بررسی مستقیم آنها در زیر میکروسکوپ است.برای این منظور می توان از روشهای زیر استفاده کرد

• بررسی و مشاهده سلولهای زنده و بدون رنگ آمیزی
• بررسی و مشاهده سلولهای مرده و رنگ آمیزی شده با مواد رنگی

باکتریهای زنده تقریبا” بی رنگ بوده و تضاد کافی با محیط خود ندارند لذا بدون رنگ آمیزی بخوبی در زیر میکروسکوپ دیده نمی‌شوند ولی از نظر شیمیایی کاملا”با محیط اطراف خود متفاوتند. این اختلاف شیمیایی اساس رنگ آمیزی آنها می گردد، زیرا ماده رنگی با مواد شیمیایی موجود در باکتریها واکنش نشان داده و موجب رنگ آمیزی آنها می شود. رنگ آمیزی علاوه بر افزایش کنتراست بین باکتری و محیط،  ممکن است به افتراق و شناسایی باکتری‌ها نیز کمک نماید رنگ های مختلفی که برای این منظور به کار می روند.این رنگ ها در حالت کلی  یا رنگ های عمومی هستند یعنی همه  باکتری ها را یکسان رنگ می کنند مثل متیلن بلو و یا بصورت رنگ های اختصاصی  و افتراقی هستند که فقط گروه خاصی از باکتری ها را رنگ آمیزی می نمایند.
با وجود پیشرفتهای تکنیکی فراوان در زمینه باکتریولوژی، مطالعه گسترش رنگ آمیزی شده هنوز به عنوان بهترین روش تشخیص فوری عفونت های باکتریال مطرح است . در این روش ، بررسی ترشحات، مواد آسپیره شده، مایعات بدنی نظیر مایع مغزی نخاعی (C.S.F) و ادرار از اهمیت خاصی برخوردار است. در این روش علاوه بر مشاهده شکل ، شناسایی و پی بردن به اندازه باکتریها و بررسی سلولهای موجود در نمونه، تشخیص فرآیند التهابی نیز امکان پذیر است.
اهداف رنگ آمیزی

• نشان دادن میکروارگانیسمها و سلولهای موجود در نمونه.
• مشاهده شکل ، اندازه وترتیب قرار گرفتن میکروارگانیسم های مورد مطالعه
• مشاهده اجزایی مانند فلاژل، اسپور، کپسول، دانه های متاکروماتیک و …
• تفکیک میکروارگانیسمها براساس خواصی چون ساختمان شیمیایی دیواره سلول . مثال رنگ آمیزی گرم

اصول رنگ‌آمیزی:
برای اینکه یک ماده بتواند باکتریها و بافتها را رنگ آمیزی کند باید علاوه بر ریشه رنگی که کروموژن نامیده می شود ریشه دیگری نیز داشته باشد که پس از حل شدن در آب یونیزه شده و ماده رنگی را دارای بار الکتریکی مثبت و منفی نماید تا بتواند با مواد اسیدی یا بازی سلولها ترکیب شود که آن را ریشه اگزوکروم می نامند. رنگ‌هائی که پس از یونیزه شدن دارای بار الکتریکی منفی باشند بنام رنگ هائی اسیدی (آنیونیک) معروف هستند رنگ‌های اسیدی مانند ائوزین، فوشین اسیدی، روزبنگال بدلیل دارا بودن بار منفی به اجزایی از سلول که دارای بار مثبت هستند اتصال پیدا می‌کنند.
رنگهائی پس از یونیزه شدن دارای بار الکتریکی مثبت باشند بنام رنگ هائی قلیایی (کاتیونیک) نامیده می شوند مانند متیلن بلو، فوشین بازی، کریستال ویوله، سافرانین و مالاشیت گرین بدلیل دارا بودن بار مثبت به اجزایی از سلول که دارای بار منفی هستند متصل می‌شوند. رنگ آمیزی بر اساس پیوند‌های یونی بین بار‌های مخالف صورت می‌گیرد. میکروب‌ها بدلیل دارا بودن شارژ الکتریکی منفی با رنگ‌های قلیایی و بازی (کاتیونیک) بهتر رنگ می‌شوند.
سطح باکتریها دارای خصوصیات اسیدی است زیرا تعداد زیادی گروه‌های کربوکسیل (-COOH) در سطح سلول قرار دارد گروه‌های کربوکسیل بنیان‌های اسیدی در اسید‌های آمینه هستند تعداد زیادی اسید آمینه در دیواره سلول وجود دارد با یونیزاسیون این گروه‌هاسطح سلول دارای بار منفی می‌شود.
-COOH              -COO^–  +  H⁺
ژنوم در باکتریها در داخل سیتوپلاسم پراکنده است اسید‌های نوکلوئیک بدلیل وجود یون‌های فسفات دارای بار منفی هستند و براحتی با رنگ‌های کاتیونیک پیوند برقرار می‌کنند.
انواع رنگ آمیزی در میکروب شناسی:
روش‌های مختلفی برای رنگ‌آمیزی باکتری‌ها وجود دارد. در یک روش آنها را به انواع ساده و مرکب تقسیم‌بندی می‌کنند.
در رنگ‌آمیزی ساده تنها از یک رنگ  مانند متیلن بلو، کریستال ویوله، سافرانین و فوشین استفاده می‌شود. در این رنگ‌آمیزی همه سلول‌ها به یک صورت رنگ می‌گیرند.
در رنگ‌آمیزی مرکب از دو یا چندین رنگ استفاده می‌شود. این نوع رنگ‌آمیزی علاوه بر تسهیل امکان مشاهده اشکال مرفولوژیک باکتری‌ها، گروه‌های مختلف باکتری‌ها را نیز از همدیگر تفکیک می‌کند. رنگ آمیزی مرکب می تواند رنگ آمیزی افتراقی، رنگ آمیزی اختصاصی و یا رنگ آمیزی انتخابی و .. باشد مانند رنگ آمیزی گرم که یک در آمیزی افتراقی بوده و در آن باکتری‌های گرم مثبت بصورت بنفش و باکتری‌های گرم منفی بصورت قرمز مایل به صورتی رنگ می‌گیرند. رنگ آمیزی ذیل نلسون نوعی دیگری از رنگ آمیزی مرکب و اختصاصی است که برای رنگ‌آمیزی باکتری‌های اسید فست (Acid Fast) مانند مایکوباکتریوم‌ها بکار می رود.
در روش دیگر آنها را به انواع مثبت و منفی تقسیم‌بندی می‌‌کنند
در رنگ‌آمیزی مثبت باکتری رنگ می‌گیرد ولی محیط رنگ نمی‌گیرد لذا باکتریها بصورت اجسام تیره و یا رنگی در یک زمینه روشن مشاهده می‌شوند. مانند رنگ‌آمیزی ساده و گرم
در رنگ‌آمیزی منفی برعکس، محیط رنگ می‌گیرد ولی بدلیل عدم توانایی نفوذ رنگ در سلول، باکتری رنگ نمی‌گیرد. لذا باکتری بصورت یک جسم روشن در یک زمینه تاریک دیده می‌شود. مانند رنگ‌آمیزی مرکب چین برای کپسول پنوموکوک.
مقدمات رنگ آمیزی :

• تهیه گسترش

لامی که برای این منظور بکار می رود باید خشک ، تمیز و عاری از چربی و ترجیحا” لام نو و تازه باشد. قبل از تهیه گسترش بایستی مشخصات بیمار یا نمونه بروی لام با مداد الماس یا ماژیک و یا برچسب خاص ثبت گردد. در صورتیکه از ماژیک برای علامت گذاری لام استفاده می شودبایستی علامت روی لام را توسط یک چسب نواری پوشانده شود تا  در وراحل شستشو پاک نشود.
برای تهیه گسترش از محیط کشت مایع با استفاده از حلقه فیلدوپلاتنین یا پیپت پاستورو یا  سواب، مقدار کمی از مایع حاوی نمونه مورد آزمایش را برداشته در وسط لام قرار دهید سپس آن را همچون ورقه نازکی روی لام گسترش دهید.هنگامی که از محیط کشت جامد گسترش تهیه می نمایید. ابتدا باید یک قطره سرم فیزیولوژی را روی لام ریخته سپس با فیلدوپلاتین مقداری از کلنی باکتری را برداشته و در قطره سرم فیزیولوژی روی لام حل کنید تا شیرابه یکنواختی تهیه شود بعد آن را در وسط لام پخش نمایید. علت اینکه از آب مقطر برای تهیه لام استفاده نمی کنیم این است که آب مقطر فشار اسمزی را تغییر داده و باعث لیز باکتری ها می شود.
برای تهیه گسترش باید مقدار مناسبی از باکتری را روی لام قرار داد چرا که اگر گسترش خیلی ضخیم باشد به معنی آن است که مقداری زیادی از باکتری روی لام قرار گرفته که می تواند مانع عبور نور شود. همچنین در گسترش ضخیم باکتری ها اغلب روی همدیگر قرار دارند و مشاهده تک تک آنها مشل می شود. گسترش ضخیم معمولا” توسط افراد مبندی و از کشت های جامد تهیه می گردد.
نقطه مقابل این مشکل تهیه گسترش خیلی نازک است یعنی تعداد بسیار کمی باکتری روی لام قرار می گیرد ودر نتیجه پیدا کردن آنها با میکروسکپ مشکل است. اینگونه گسترش ها بیشترازمحیط کشت های مایع تهیه می گردند.

• لام تهیه شده نباید وسیع باشد به عبارت دیگر اسمیر تهیه شده بهتر است در وسط لام و به میزان مناسب تهیه شود.
• نکته بسیار مهمی که باید در تهیه لام به آن دقت کرد این است که همیشه باید از یک کلنی مشخص بر روی محیط کشت نمونه برداری کرد تا در بررسی میکروسکوپیک دچار سردرگمی نشویم.
• خشک کردن :(Drying)

پس از تهیه گسترش لام را روی  سطحی صاف و هموارقرار داده  و صبر کنید تا در دمای معمولی آزمایشگاه خشک گردد . برای خشک کردن نباید از روشهای دیگر استفاده کرد.

• ثابت کردن(Fixation) :

چون ممکن است براثر رنگ آمیزی و شستشوی مکرردر مراحل مختلف رنگ آمیزی، باکتریها از روی لام کنده شوند، لازم است گسترش را ثابت نماییم تا بطریقی باکتریها مرده و به سطح لام بچسبند. اسمیرها ی تهیه شده ممکن است با حرارت یا متانول فیکس شوند.
الف-  تثبیت گسترش با استفاده از حرارت یا روش فیزیکی:
در روش فیزیکی که روش متداول و مرسوم می باشداز حرارت استفاده می‌شود این روش یکی از ساده ترین روش‌هاست در این روش لام حاوی گسترش را ۳-۴ بار از روی شعله چراغ بنسون عبور می‌دهند.
این مرحله از حساسیت زیادی برخوردار است برای اینکه استفاده از حرارت زیاد باعث تخریب ساختار و از بین رفتن باکتری‌ها و سلولها شده و در صورت عدم حرارت کافی فیکساسیون و تثبت بدرستی انجام نشده و در طی مراحل رنگ‌آمیزی گسترش روی لام شسته شده و از بین خواهد رفت. برای در نظر گرفتن حرارت مناسب که حدود۷۰ درجه سانتیگراد است بهتر است با پشت دست امتحان کنیم بدین ترتیب که قسمت پشت لام را چندین مرتبه به آهستگی از روی شعله چراغ عبور داد بحدی که در صورت تماس با پشت دست آنرا نسوزاند.  سپس بگذارید لام قبل از رنگ آمیزی کاملا”خنک شود.
ب- روش شیمیایی : در روش شیمیایی که بهترین روش تثبیت لام می باشد از الکل متانول استفاده می‌شود از آنجا که حفظ مشخصات سلولهای میزبان جهت تفسیر گستره های بالینی ضروری است بهترین روش برای رنگ آمیزی گستره های مستقیم، فیکس کردن با استفاده از متانول است. این امر با ممانعت از لیز گلبول های قرمز و تخریب سلول های میزبان موجب واضح تر شدن زمینه اسلاید می گردد که تفسیر نمونه راآسانتر میکند. این روش برای همه نمونه های بالینی، مخصوصاً ادرار موکدا” توصیه می شود که در عین حال مانع از شسته شدن نمونه های ادرار می گردد.
برای یک دقیقه چند قطره متانول روی لام بریزید. متانول را بدون آبکشی از روی لام خالی کنید و اجازه دهید تا بقایای الکل تبخیرگردد و اسلاید در مجاورت هوا خشک شود.
بطور کلی ثابت کردن باعث انعقاد پروتئینهای باکتری و سلولها می گردد و به لام می چسبند و شسته نمی شوند.