رنگ آمیزی دانه های ولوتین یا متاکروماتیک در باکتری ها (Volutin- Metachromatic Granules)

در سیتوپلاسم بسیاری از باکتری ها دانه هایی موجود است که اگر با آبی متیلن یا آبی تلوئیدین رنگ آمیزی شوند به رنگ قرمز یا بنفش درمی آیند که به آنها دانه های باب ارنست یا ولوتین یا دانه های متاکروماتیک می گویند متاکروماتیک از کلمه متاکرومازی به معنی تغییر رنگ گرفته شده است. این دانه ها میل ترکیبی شدیدی با رنگ های بازی دارند به نظر می رسد رنگ پذیری دانه های متاکروماتیک در باکتری های مختلف متفاوت است . دانه های ولوتین از فسفات غیرآلی و تعداد قابل توجهی اسید ریبونوکلئیک ، لیپید و پروتئین تشکیل شده است. هر چند نقش این دانه ها هنوز ناشناخته است اما با توجه به ترکیبات این دانه ها احتمالا” به عنوان یک منبع ذخیره انرژی بکار می روند. آنها در کشت های کهنه (حداقل ۷۲ ساعته) و قبل از شروع فقر غذایی باکتری دیده می شود. دانه های متاکروماتیک در بسیاری ازانواع باکتری ها وجود دارند اما توجه میکروب شناسان بالینی بیشتر معطوف به جنس کورینه باکتریوم است. این جنس شامل عامل مولد دیفتری و هم چنین دیفتروئیدهای معروف است. دیفتروئیدها با کورینه باکتریوم دیفتریه (عامل دیفتری) شباهت داشته و از خیلی جهات بهم شبیه اند، ولی دیفتروئیدها فلور طبیعی گلو، پوست انسان و … بوده و غیربیماریزا هستند. دیفتروئیدها دارای آرایش یاخته ای خاصی موسوم به نرده ای هستند طرز قرارگرفتن این باکتریها اکثراً متقاطع بوده که آن را به حروف چینی با الفبای لاتین تشبیه می کنند. برای مشاهده دانه های متاکروماتیک می توان از روش رنگ آمیزی آلبرت یا نایسر استفاده نمود در رنگ آمیزی آلبرت، دانه ها به رنگ آبی مایل به سیاه و باکتری به رنگ سبزه و در رنگ آمیزی نایسر، دانه ها به رنگ آبی و باکتری به رنگ قهوه ای دیده خواهد شد. این دانه ها کمی به اسید و الکل نیز مقاوم بوده و در مقابل عمل رنگ بری اسید سولفوریک یک درصد مقاومت دارند این دانه ها نور را بیش از پروتوپلاسم می شکنند و گاهی در لام های رنگ نشده قابل تشخیص هستند.
 
 
الف) رنگ آمیزی دانه های متاکروماتیک به روش آلبرت:
محلول های مورد نیاز:

• رنگ آلبرت(Albert stain):
• Toluidine blue 15 gm.
• Malachite green 20 gm.
• Glacial acetic acid 0 ml
• Alcohol(95%) 0 ml
• Distilled water 100 ml

رنگها در الکل حل نموده سپس به آن مقداری آب مقطر و اسید استیک گلاسیال ضافه نموده و به آرامی مخلود نموده و در نهایت مابقی آب مقطر اضافه می شود. رنگ تهیه شده را ۲۴ ساعت انکوبه نموده و پس از فیلتر نمودن استفاده می کنیم.

• محلول لوگل(Lugol’s iodine solution ) :
• Iodine        ۲
• Potassium iodide (KI)    ۳ gm.
• Distilled water 300 ml

در مقدار کمی از آب‌ مقطر، ید و یدور پتاسیم را کاملاً حل نمایید، بعد حجم را با آب‌ مقطر به ml3000‌ برسانید.
روش آزمایش:

• گسترشی از کورینه باکتریوم تهیه نمایید.
• پس از خشک شدن به آرامی لام را با حرارت ثابت نمایید.
• رنگ آلبرت را روی لازم بریزید و به مدت ۵ دقیقه گسترش را با آن بپوشانید.
• بدون شستشو با آب، رنگ اضافی را از روی لام خالی نمایید.
• محلول لوگل را روی لام مرطوب اضافه کرده و به مدت یک دقیقه صبر کنید.
• لام را شسته و صبر کنید تا خشک شود.
• با عدسی ۱۰۰ میکروسکوپ مشاهده کنید و طرز قرار گرفتن باکتری ها و رنگ های آن ها را در گزارش کارتان ترسیم کنید.

دانه های متاکروماتیک به رنگ آبی تیره یا بنفش در سیتوپلاسم باکتری ها که سبز رنگ شده اند دیده می شود.
 
 
 
ب ) رنگ آمیزی دانه های متاکروماتیک روش نایسر(Neisser Method):

• گسترشی از کورینه باکتریوم تهیه نمایید.
• صبر کنید تا گسترش خشک شود سپس با حرارت آن را ثابت نمایید.
• با رنگ نایسر به مدت ۱۰ ثانیه گسترش را بپوشانید و سپس با آب شستشو دهید.
• بامحلول ۲% بیسمارک به مدت ۳۰ ثانیه گسترش را بپوشانید.
• لام را با آب بشویید و صبر کنید تا خشک شود.
• با عدسی ۱۰۰ میکروسکوپ مشاهده کنید و مشاهدات خود را ترسیم نمایید.

در این روش دانه های متاکروماتیک به رنگ آبی تیره و باکتری ها به رنگ قهوه ای روشن مشاهده می شود.
رنگ آمیزی دانه های چربی(Lipid Granules Stain):
در سیتوپلاسم برخی از باکتری ها قطرات چربی وجود دارد که میل ترکیبی با رنگ های محلول در چربی مانند سودان سیاه  را دارند. سودان سیاه قطرات چربی را سیاه رنگ می کند در حالی که پروتوپلاسم باکتری بی رنگ باقی می ماند. البته می توان آن را فوشین یا سافرانین رنگ نمود. قطرات چربی بیشتر از پلی بتاهیدروکسی بوتیرات یا بتاهیدروکسی بوتیریک اسید پلیمریزه، تشکیل شده است محتویات چربی باکتری ها در شرایط مختلف زندگی متغیر است و ممکن است به مواد یا انرژی مورد نیاز باکتری تبدیل شود.
در برخی از باسیلوس ها، سودوموناس ها، مخمرها و ازتوباکترها دانه چربی یافت می شود که ممکن است حدود ۳۰ درصد وزن باکتری را تشکیل دهد. این دانه ها اندکی به اسید و الکل مقاومند و اگر آنها را با روش تغییر یافته ذیل – نلسون (مخصوص رنگ آمیز اسپور) رنگ آمیزی کنیم مانند اسپورها رنگ قرمز را به خود می گیرند همچنین در رنگ آمیزی گرم نیز مانند اسپورها بی رنگ هستند و ممکن است مبتدیان آن را با اسپور اشتباه کنند اما در نظر داشته باشید که دانه های چربی از اسپور کوچک ترند و اغلب در هر باکتری بیش از یک دانه وجود دارد.
روش آزمایش سودان:

• گسترشی از باکتری باسیلوس سوبتیلیس یا مخمر کاندیدا تهیه نمایید.
• صبر کنید تا گسترش خشک شود سپس با حرارت ثابت کنید.
• با محلول سودان سیاه به مدت ۱۰ دقیقه گسترش را بپوشانید و سپس با آب بشویید.
• تکه ای کاغذ صافی را روی گسترش قرار دهید تا آب های باقیمانده را جذب کند.
• به آرامی کاغذ صافی را برداشته چند قطره گزیلن روی گسترش بریزید تا نمایان شود.
• لام را به آرامی با کاغذ خشک کن خشک کنید.
• با سافرانین به مدت ۳۰ ثانیه گسترش را بپوشانید.
• رنگ را خالی کنید و لام را با آب بشویید سپس صبر کنید تا لام خشک شود.
• سپس با عدسی ۱۰۰ مشاهده نموده و مشاهدات خود را ترسیم نمایید.
• دانه های چربی به رنگ آبی تیره و سیتوپلاسم باکتری به رنگ قرمز مشاهده می شود.
• طرز تهیه محلول سودان سیاه: ۵۰ میلی لیتر استون را به ۵۰ میلی لیتر اتانول ۷۰ درصد افزوده و سپس سودان سیاه را تا رسیدن به حد اشباغ در آن حل نمایید.

رنگ آمیزی دانه های ذخیره ای پلی ساکاریدی :
برخی از باکتری ها دارای دانه های ذخیره ای از جنس گلیکوژن هستند (گلیکوژن پلیمری است از واحدهای گلوکز که توسط پیوند آلفا ۴-۱ به هم متصل اند). این نوع دانه ها در بسیاری از باکتری ها بویژه انتروباکتریاسه ها یافت می شود. در برخی از باکتری ها نیز دانه های ذخیره ای از جنس نشاسته وجود دارد که می توان آنها را با محلول یددار رنگ آمیزی نمود. دانه های گلیکوژن به رنگ قهوه ای مایل به قرمز و دانه های نشاسته به رنگ آبی مشاهده می شوند. دانه های ذخیره ای کربوهیدراتی که در رنگ آمیزی فوق به رنگ آبی در آیند آیوژن(Iogen) یا گرانولوز (Granulose)نامیده می شوند و بطور معمول در باکتری های بی هوازی اسپوردار مشاهده می شوند.
الف: روش آزمایش (روش لام مربوطوب)

• قطره ای آب روی لام قرار دهید.
• با استفاده از فیلدوپلاتین مقداری از کلنی مخمر را در قطره روی لام حل کنید.
• قطره ای از محلول لوگل را با سوسپانسیون روی لام مخلوط کنید.
• لامل را روی آن قرار داده و در زیر میکروسکوپ با عدسی روغنی مشاهده کنید.

ب : روش آزمایش (استفاده از لوگل و سافرانین):

• گسترشی از باکتری اشریشیاکلی تهیه کنید و صبرکنید تا خشک شود.
• بدون ثابت کردن گسترش با محلول لوگل به مدت ۲ دقیقه آن را بپوشانید.
• محلول را از روی لام خالی کرده و آن را با آب بشویید.
• با سافرانین به مدت ۳۰ ثانیه گسترش را بپوشانید.
• به آرامی با آب بشویید و صبر کنید تا خشک شود.
• با عدسی ۱۰۰ و روغن ایمرسیون در زیر میکروسکوپ مشاهده کنید.
• مشاهدات خود را در گزارش کارتان ترسیم نمایید.
• باکتری به رنگ قرمز و دانه ها به رنگ قهوه ای تیره مشاهده می شوند.