راهنمای کامل رنگ آميزي گرم در باکتری ها

اصول:  
در آزمايشگاه ميكروب شناسي باليني، رنگ آميزي گرم آزمايشي مهم براي تشخيص احتمالي سريع عوامل عفوني است و كيفيت نمونه هاي باليني را ارزيابي مي كند . اين آزمايش براي طبقه بندي باكتري ها بر اساس شكل، اندازه، مورفولوژي سلول و واكنش گرم آنها به كار مي رود.
تفسير گسترش هايي كه رنگ آميزي گرم شده اند، با در نظر گرفتن مشخصه هاي رنگ آميزي ، اندازه، شكل و آرايش سلول صورت می گيرد. اين مشخصه ها ممكن است بوسيله بسياري از فاكتورها مانند مدت زمان ماندگی پليت ها، محيط کشت، اتمسفر انكوباسيون ، روش رنگ آميزي و وجود مواد مهاركننده تحت تأثير قرار بگيرند. براي تفسير اسميرهاي تهيه شده از نمونه هاي باليني مانند خلط، به وجود عوامل اضافي مانند انواع سلول هاي ميزبان و فاگوسيتوز نيز می بايست دقت نمود .
 
نمونه:
اسمير براي رنگ آميزي گرم ممكن است از نمونه هاي باليني، محيط براث يا كلني هاي رشد كرده روي محيط كشت جامد تهيه شود. نمونه هاي باليني تازه وكشت هاي تازه (كمتر از ۲۴ ساعت) از محيط هاي غيرمهاركننده ، صحيح ترين نتايج را مي دهند؛براي برخي بررسي هاي مورفولوژيكي، اسمير تهيه شده از كشت براث مورد نياز مي باشد.
 
مواد:

1. A. معرف ها

معرف ها ممكن است به صورت تجاري خريداري شوند يا در آزمايشگاه تهيه گردند.
۱- Hucker’s modification

1. كريستال ويوله
2. يد

احتياط: يد خاصيت خورندگي دارد. از استنشاق، خوردن يا تماس آن با پوست خودداري كنيد.
.c رنگ برها

• كندترين رنگ بر: اتانول  ۹۵ %
• رنگ بر متوسط: استون ـ الكل؛ مخلوطي از ml 100 اتانول ۹۵% و  ml100 استون (reagent grade ) را در بطري شيشه اي قهوه اي رنگ تركيب كنيد، با يك سال تاريخ انقضاء، برچسب بزنيد و در حرارت اتاق نگهداري كنيد.
• سريع ترين رنگ بر: استون (reagent grade )

 
احتياط: اتانول و استون قابل اشتعال هستند.
      

1. d. Counterstains (رنگ متقابل)

• سافرانين
• به طور جايگزين: فوشين بازي (wt/vol) 2/0% يا ۱/۰%

 
 
 
۲- Kopeloff’s modification for anaerobes
۳- Carbol-fuchsin−basic fuchsin counterstain
 
.B وسايل و مواد مورد نياز

• لام شيشه اي ( mm75×۲۵)
• NaCl 85/0% استريل
• پي پت پاستور و اپليكاتور چوبي استريل
• لوپ ميكروب شناسي، آنس تلقيح سازي
• Safety box براي دور ريختن زباله بيولوژيك شامل وسايل نوك تيز
• روغن ايمرسيون

 

1. C. تجهيزات

موارد اختياري با توجه به نوع نمونه
۱- سانتريفوژ
۲- ورتكس
۳- لوله درپيچ دار استريل
۴- قيچي، اسكالپل و پنس استريل
۵- خردكن بافت

• متانول خالص

 
نكته: متانول را در بطري هاي درپيچ دار قهوه اي ذخيره كنيد. ذخيره كاري را مي توان در ظروف پلاستيكي براي حداكثر دو هفته ذخيره نمود .
 
كنترل كيفي:
.A روزانه معرف ها را از نظر ظاهري بررسي كنيد.
۱-  اگر كريستال ويوله رسوب كرده يا ته نشين شده، قبل از استفاده آن را صاف كنيد، حتي زماني كه معرف ها به صورت تجاري خريداري مي شوند.
نكته: بعضي رنگ ها، خصوصاً فوشين بازي و سافرانين مي توانند آلوده شوند. در صورت شک به آلودگی ،  انجام رنگ آميزی با استفاده از معرف تازه توصيه ميگردد .
۲- تبخير شدن مواد ممكن است كارايي و تأثير معرف ها را دگرگون كند. اگر محلول هاي كاري با مصرف روزانه تمام نمي شوند، بايد به طور منظم تعويض شوند.
 
.B به طور روزانه و زماني كه يك سري ساخت جديد استفاده مي شود، گسترشي از اشريشيا كلي (ATCC 25922) و استافيلوكوك اپيدرميديس (ATCC 12228) و يا استافيلوكوك اورئوس (ATCC 25923) تهيه و فيكس کرده و مطابق روش فوق رنگ آميزي كنيد.
 
نتايج مورد انتظار:
۱ – باسيل هاي گرم منفي، صورتي
۲- كوكسي هاي گرم مثبت، بنفش پررنگ
توجه:بعنوان روش كنترل كيفي جايگزين پيشنهاد ميشود با يك اپليكاتور چوبي از بين دندان ها نمونه گيري شود؛ هم ارگانيسم هاي گرم مثبت و هم گرم منفي وجود خواهد داشت.
.C  برخی از علل رايجی که موجب تهيه اسلايد رنگ آميزی گرم نامناسب می گردند:
۱-  استفاده از لام هاي شيشه اي كه قبلا تميز يا چربي زدايي نشده اند.
          توجه: با ذخيره لام ها در ظرف حاوي اتانول ۹۵%  از تميز بودن آنها مطمئن خواهيم بود. قبل از استفاده، الكل اضافي را از
روي لام خالي كنيد يا آن را روي شعله بگيريد.

• گسترش ها خيلي ضخيم تهيه شده است.
• حرارت دادن زياد گسترش، زماني كه براي فيكس كردن از حرارت ا ستفاده مي شود.
• آب كشي زياد در طي فرايند رنگ آميزي

 
.D براي اطمينان از صحت تفسير، سيستمي براي بررسي گزارش هاي رنگ آميزي گرم برقرار كنيد.
۱- بررسي روزانه تعدادي از رنگ هاي گرم توسط سوپروايزر
۲-  مقايسه نتايج كشت نهايي با گزارش هاي رنگ آميزي گرم
۳-  گردآوري مجموعه اي از لام هاي مرجع براي آموزش
 
روش انجام آزمايش:

1. A. تهيه اسمير

اسمير مناسب بايد لايه اي از ارگانيسم ها با تراكم مناسب براي مشاهده آسان ايجاد نمايد. پراکندگی ارگانيسم ها می بايست به نحوی باشد که آرايش آنها مشخص شود. برای تهيه اسمير از لام هاي شيشه اي نو و تميز استفاده نماييد.
نكته: زماني كه از يك پي پت يا سواب براي تهيه اسمير و تلقيح محيط كشت استفاده مي كنيد، هميشه قبل از تهيه اسمير، ابتدا محيط كشت را تلقيح كنيد.
  ۱- نمونه هاي باليني:
نكته : استفاده از دستكش لاتكس در زمان كار روي نمونه هاي باليني ضروري است .

1. a. نمونه هاي دريافت شده روي سواب

ترجيحاً بايد يك سواب جداگانه برای تهيه اسمير آماده شود .

• جهت جلوگيري از تخريب عناصر سلولي و از بين رفتن آرايش باكتريايي، به آرامي سواب را در سرتاسر لام بچرخانيد.
• در مواردي كه فقط يك سواب دريافت مي شود، سواب را در مقدار كمي سالين قرار داده و آن را ورتكس كنيد. سواب را به ديواره داخلي لوله بفشاريد و آن را براي تهيه گسترش به كار ببريد. از باقيمانده سوسپانسيون براي تلقيح محيط كشت استفاده كنيد.

 

1. b. نمونه هايي كه روي سواب دريافت نمي شوند شامل: آسپيره ها، ترشحات، چرك، مدفوع

۱)  اگر نمونه در يك سرنگ دريافت شده باشد، ابتدا تمامي آن را در يك لوله استريل بريزيد. در صورت كافي بودن حجم نمونه آن را ورتكس كنيد.
نكته: سرنگ هاي همراه سوزن را ، نپذيريد. به كاركنان مربوطه جداسازي ايمن سوزن ها را آموزش دهيد .
۲)  با استفاده از يك اپليكاتور، پي پت يا لوپ سيمي استريل قسمت هاي چركي يا خوني  نمونه را انتخاب كنيد. نمونه هاي خيلي غليظ يا نمونه هاي چركي را مي توان در يك قطره سالين روي لام رقيق نمود تا تهيه اسمير آسان تر شود.
۳)  نمونه را روي منطقه بزرگي از لام پهن كنيد تا يك لايه نازك ايجاد شود.
 
.c CSF و ساير مايعات بدن كه نياز به سانتريفوژ دارند
بعضي از آزمايشگاهها ممكن است برای تغليظ مايعات بدن و تهيه اسمير از Cytopsin Slide Centrifuge استفاده كنند. اين روش به افزايش حساسيت رنگ گرم ،كاهش زمان سانتريفوژ و دسترسی سريعتر به نتيجه کمک می نمايد.
۱ ) بعد از انجام سانتريفوژ، با استفاده از پي پت استريل، محلول رويي را به يك لوله استريل منتقل كنيد، حدود ml 5/0 را به عنوان رسوب باقي بگذاريد.
۲ )  رسوب را ورتكس كرده يا با چند بار داخل و خارج كردن از يك پي پت پاستور استريل آنرا كاملا مخلوط نماييد.
۳ )  با استفاده از پي پت پاستور يك قطره كوچك از رسوب را روي يك لام تميز قرار دهيد.
۴ )  قطره را پخش نكنيد. اجازه دهيد تا در مجاورت هوا خشك شود.
 
.d نمونه هاي ادرار
۱)   سانتريفوژ نكنيد. نمونه را به خوبي مخلوط كنيد.

• با استفاده از يك پي پت پاستور استريل ۱ قطره را روي لام قرار دهيد. قطره را پخش نكنيد.
• اجازه دهيد قطره در مجاورت هوا خشك شود.

 

1. e. مواد خشك يا مقادير خيلي كم نمونه هاي باليني:

• نمونه را در ml 5/0 سالين استريل حل كنيد. در صورت نياز ورتكس نماييد.
• با استفاده از پي پت پاستور استريل ۱ قطره را روي لام قرار دهيد.
• با استفاده از نوك پي پت، قطره را پخش كنيد تا لايه نازكي ايجاد شود.

 
.f بيوپسي ها و برش هاي بافت
تهيه نمونه حاصل از تماس مستقيم اسلايد با سطح نمونه (touch prep) و/يا نمونه خرد شده (ground specimen)
۱)بافت را با استفاده از قيچي يا اسكالپل استريل خرد كنيد.
۲) نمونه اي حاصل از تماس مستقيم اسلايد با سطح نمونه (touch prep) تهيه كنيد. با استفاده از پنس استريل قطعه ها را نگه داريد و كناره هاي يك يا تعداد بيشتري از قطعات خرد شده را با اسلايد شيشه اي استريل تماس دهيد، براي بررسي آسانتر تماس ها را با هم دسته بندي كنيد.
۳) براي نمونه هاي تماسي يكنواخت، يك قطره را روي اسلايد قرار دهيد و به اندازه يك دايره ۵/۲ سانتي متري پخش كنيد.
 
۲- كشت هاي براث:
براي جلوگيري از مخلوط شدن نمونه هاي مختلف روي يك لام ، توصيه مي شود روي هر اسلايد، يك گسترش تهيه شود.
 

1. a. با استفاده از پي پت پاستور استريل (يا يك سوزن منفذدار، براي ظروفي مثل بطري هاي كشت خون، جهت جلوگيري از آلودگي با سوزن و سرنگ) يك قطره روي لام قرار دهيد.
2. b. قطره را پخش كنيد تا لايه نازكي ايجاد شود.

 
۳- كلني از روي محيط هاي كشت جامد:

1. a. يك قطره سالين يا آب مقطر استريل روي لام قرار دهيد.
2. b. مقدار كمي از كلني را با يك اپليكاتور، آنس يا لوپ استريل برداريد.

c . به آرامي مخلوط كنيد تا سوسپانسيون يكنواختي حاصل گردد.
 

1. B. فيكس كردن اسمير (گسترش):

اسميرها ممكن است با حرارت يا متانول فيكس شوند.
۱-  حرارت:

1. a. اسمير را در مجاورت هوا روي يك سطح صاف يا داخل اتو قرار دهيد تا خشك شود.
2. b. اگر اسميرها در مجاورت هوا خشك شدند، آنها را ۲ يا ۳ بار از روي شعله بگذرانيد. براي جلوگيري از سوختگي يا تغيير شكل سلول ها، از حرارت زياد استفاده نكنيد .
3. c. بگذاريد لام قبل از رنگ آميزي خنك شود.

• از آنجا كه حفظ مشخصات سلولهاي ميزبان جهت تفسير گستره هاي باليني ضروري است بهترين روش براي رنگ آميزي گستره هاي مستقيم، فيكس كردن با استفاده از متانول است. اين امر با ممانعت از ليز گلبول های قرمز و تخريب سلول هاي ميزبان موجب واضح تر شدن زمينه اسلايد می گردد كه تفسير نمونه راآسانتر ميكند.اين روش براي همه نمونه های باليني، مخصوصاً ادرار موکدا توصيه مي شود كه در عين حال مانع از شسته شدن نمونه هاي ادرار مي گردد.

1. a. اسمير را در مجاورت هوا روي يك سطح صاف خشك نماييد.
2. b. براي ۱ دقيقه چند قطره متانول روي لام بريزيد. متانول را بدون آبكشي از روي لام خالي كنيد و اجازه دهيد تا اسلايد در مجاورت هوا خشك شود.
3. c. قبل از رنگ آميزي، از حرارت استفاده نكنيد.

.C روش انجام رنگ آميزي:
۱- Hucker’s modification

1. a. اسمير فيكس شده را با محلول كريستال ويوله بپوشانيد. ۳۰ ثانيه منتظر بمانيد.
2. b. آهسته كريستال ويوله را خالي كنيد، اسلايد را به آرامي با آب جاري بشوئيد.

احتياط: شستشوي بيش از حد در اين مرحله مي تواند باعث شسته شدن كريستال ويوله از سلول هاي گرم مثبت شود. براي اطمينان از جريان آرام آب در سمت اسميردار لام، اسلايد را به صورت زاويه دار نگه داريد.

1. c. آب اضافي را با محلول يد شستشو دهيد و سپس اسلايد را با محلول يد تازه بپوشانيد. ۳۰ ثانيه منتظر بمانيد.
2. d. اسلايد را به آرامي با آب جاري بشوئيد.
3. e. با جاري كردن معرف روي گستره در حالي كه اسلايد زاويه دار نگه داشته شده است، رنگ بري كنيد. وقتي مايع جاري ، بي رنگ مي شود اين كار را به اتمام برسانيد. زمان رنگ بري را بر اساس ضخامت اسمير و نوع رنگ بر مورد استفاده تنظيم كنيد.
4. f. رنگ بر اضافي را با جريان آرام آب خارج كنيد.

نكته: اسميري كه بطور مناسب رنگ بري شده است، با ته رنگ سبز زيتوني و بدون آثاري از رنگ كريستال ويوله ديده خواهد شد.

1. g. اسلايد را با سافرانين بپوشانيد و اجازه دهيد رنگ متقابل(counter stain) براي ۳۰ ثانيه باقي بماند.
2. h. رنگ متقابل اضافي را با جريان آرام آب خارج كنيد.
3. i. اسلايد را در وضعيت ايستاده در مجاورت هوا خشك كنيد. پشت لام را با استفاده از دستمال كاغذي آغشته به استون يا الكل پاك كنيد.
4. j. اسمير را از نظر ميكروسكوپي بررسي كنيد.

۲- carbol-fuchsin counterstain/Basic
carbol-fuchsin /Basic براي شناسايي ارگانيسم هاي گرم منفي كه رنگ كمي گرفته اند به كار مي رود.
۳- Kopeloff’s modification
براي مشاهده و افتراق بهتر بي هوازيها توصيه مي شود از  روش رنگ آميزيKopeloff’s modification استفاده شود .
 
گزارش نتايج:

1. A. نتايج و تفسير

۱- وضعيت كلي اسمير را با بزرگنمايي كم (۱۰× ) ارزيابي كنيد.

1. a. دقت نماييد كه اسمير بطور مناسبي رنگ بري شده باشد. بسته به نوع نمونه، زمينه عموما بايد شفاف يا صورتي باشد. اگر گلبول هاي سفيد وجود دارند، بايدبه صورت گرم منفي ظاهر شوند. رسوب هاي نازك سوزني شكل كريستال ويوله را با باكتري هاي ميله اي شكل گرم مثبت اشتباه نگيريد.
2. b. دقت نماييد ضخامت اسمير مناسب باشد. براي تفسير مناسب، گستره نميبايستي بيش از يك سلول ضخامت داشته و روي هم افتادگي سلول ها نبايد مشاهده شود.

 
۲- اسميرهاي تهيه شده از نمونه هاي باليني را جهت بررسي موارد زير با بزرگنمايي كم بررسي كنيد:

1. a. مقادير مربوط به نوتروفيل ها، مونوسيت ها و گلبول هاي قرمز
2. b. مقادير مربوط به سلول هاي اپي تليال و باكتري هاي فلور نرمال كه ممكن است نشانگر جمع آوري نامناسب نمونه باشد.
3. c. وضعيت و آرايش ميكروارگانيسم ها

 
۳- مناطق متعددي از اسمير را با روغن ايمرسيون از نظر وجود ميكروارگانيسم ها بررسي و به شيوه زير گزارش  كنيد.

1. a. در صورت عدم مشاهده هر گونه ميكروارگانيزم :”هيچ ميكروارگانيسمي مشاهده نشد”.
2. b. در صورت مشاهده ميكروارگانيزمها ، تراكم كلي و مرفولوژي را شرح دهيد.

 
۴- شكل سلولي غالب ميكروارگانيسم ها را ذكر نماييد

1. a. شكل كلي: كوكوس، كوكوئيد، كوكوباسيل، باسيل، رشته اي شكل، شبه مخمر
2. b. ظاهر انتهاها: كروي، شمعي شكل، مسطح، گرزي شكل، مقعر. برآمدگی كناره ها مي تواند وجود اسپورها را پيشنهاد كند، اما مي تواند به علت واكوئل ها، پلئومرفيسم، يا رنگ آميزي نامنظم باشد.
3. c. ظاهر كناره ها: موازي، تخم مرغي شكل (برآمده)، مقعر، نامنظم
4. d. ماهيت محور تقارن: مستقيم، منحني، فنري
5. e. پلئومرفيسم (ناپايداري در شكل): عبارت توصيفي “ديفتروئيد” يا “كورينه فرم” براي توصيف باسيل هاي گرم مثبت به كار مي رود كه چند شكلي، گرزي شكل يا نامنظم و بي قاعده هستند يا آرايش نرده اي يا زاويه دار دارند (اشكال VوL ).
6. f. گسترش شاخه اي يا سلولي

 

1. B. ثبت مشاهدات

هر آزمايشگاه بايد سياست گزارشدهي ويژه اي را تدوين كند. يافته هاي مهم باليني بايد جهت اطلاع به پزشك معالج اعلام شود.
– اسمير نمونه هاي باليني
براي كشت هاي ادرار ۲۰ فيلد يا بيشتر را بررسي كنيد. اگر بطور ميانگين،ن يك ارگانيسم يا بيشتر در فيلد روغن ايمرسيون ديده مي شود، مثبت گزارش كنيد. اين با كلني كانت CFU/ml 10⁵ ≤ همبستگي دارد.

1. a. مقادير مربوط به سلول ها و ميكروارگانيسم هاي مشاهده شده را گزارش دهيد. معمولا سيستم هاي كمي مورد استفاده شامل موارد زير است.

۱) عددي
(a +1 ( 1> در فيلد روغن ايمرسيون ]×‍۱۰۰‍‌‍[)

1. b) +2 ( 1 در فيلد روغن ايمرسيون)
2. c) +3 ( 2 تا ۱۰ در فيلد روغن ايمرسيون)
3. d) +4 ( غالب يا ۱۰< در فيلد روغن ايمرسيون)

۲) توصيفي

1. a) كمياب (۱< در فيلد روغن ايمرسيون)
2. b) كم (۱ تا ۵ در فيلد روغن ايمرسيون)
3. c) متوسط (۵ تا ۱۰ در فيلد روغن ايمرسيون)
4. d) زياد (۱۰< در فيلد روغن ايمرسيون)
5. b. مرفولوژي باكتري هاي مشاهده شده را ثبت كنيد.

 

1. C. مرور رنگ آميزي گرم

۱- بعد از تفسير اسميرها، اسلايدها را به مدت كافي براي مرور تأييدي نگه داريد .

1. a. روغن اضافي را خالي كنيد يا به آرامي پاك كنيد.
2. b. براي اسلايدهاي كتابخانه و مجموعه هاي آموزشي كه براي مدت زمان طولاني تري ذخيره خواهد شد، روغن ايمرسيون را مي توان با محلول گزيلن پاك كرد و با يك درزگير نظير محلول permountپوشاند تا از محوشدگي آنها جلوگيري شود.
3. c. اسلايدها ممكن است كيسه هاي خطر زيستي را سوراخ كنند، آنها را به عنوان مواد زائد بيولوژيك ” تيز و برنده” در نظر گرفته

و جهت دفع از ظروف خطر زيستي (biohazard) مطابق با دستورالعمل دفع پسماند آزمايشگاه مرجع سلامت استفاده كنيد.
۲- اگر تكرار رنگ آميزي گرم يا يك رنگ آميزي ويژه براي تأييد يافته ها لازم است، وقتي اسميرهاي رنگ نشده اضافي در دسترس نيستند، يك اسمير رنگ گرم را مي توان رنگ بري نمود.

1. a. روغن ايمرسيون را با محلول گزيلن از روي اسلايد برداريد.
2. b. اسلايد را با الكل- استون بپوشانيد تا اسمير بي رنگ شود.
3. c. دوباره رنگ كنيد.

 
توجهات :

1. A. نتايج رنگ آميزي گرم ميبايستي در تطابق با ساير يافته هاي باليني و آزمايشگاهي مورد استفاده قرار گيرد.
2. B. براي كسب نتايج صحيح، پيروي دقيق از روش انجام آزمايش و معيارهاي تفسير الزامي مي باشد. صحت، ارتباط زيادي با آموزش و مهارت شخص مشاهده كننده اسلايد دارد.
3. C. مشاهده ميكروارگانيزم هاي گرم مثبت و نمونه هاي كشت منفي ممكن است در نتيجه آلودگي معرف ها و ساير لوازم، حضور عوامل ضدميكروبي، يا كاهش رشد ارگانيسم ها تحت شرايط كشت معمول (محيط كشت ، اتمسفر و غيره) باشد.
4. D. نتايج گرم نادرست ، ممكن است مربوط به كيفيت نامناسب جمع آوري نمونه باشد.
5. E. ممكن است گاهي واكنش رنگ آميزي گرم با كلني هاي خيلي تازه در مقايسه با كلني هاي كهنه تر متفاوت باشد. وقتي كه اسميرها از ساب كالچر ۲۴ – ۱۸ ساعته تهيه مي شوند (زماني كه سلول هاي باكتريايي در فاز لگاريتمي رشد هستند)، مرفولوژي اغلب باكتري ها در رنگ آميزي گرم، در بهترين شرايط مي باشد.