اساس اندازه گیری پروتئین در ادرار به صورت کمی و نیمه کمی و کیفی بر پایه روشهای ایمونوشیمی، کدورت سنجی و شیمیایی با استفاده از نوارهای تشخیصی می باشد. در این میان روش کدورت سنجی به علت ساده و مقرون به صرفه بودن در آزمایشگاهها کاربرد بیشتری دارد. با توجه به تحقیقات انجام شده روش TCA با استفاده از طول موج ۴۰۵ نانومتر برای سنجش مقادیر کم پروتئین به عنوان روش انتخابی معرفی می شود.
ضمناً در بررسی روشها، عوامل کیفی شامل صحت، دقت، محدوده اندازه گیری، خطی بودن و یکنواختی نتایج در استفاده از کالیبراتورهای متفاوت تعیین گردیده و سپس روش اصلح انتخاب شده است.
اساس آزمایش
در این روش پروتئین ادرار توسط تری کلرواستیک اسید ۵/۱۲در صد رسوب داده می شود. کدورت ایجاد شده متناسب با مقدار پروتئین (آلبومین و گلبولین) موجود در ادرار است. غلظت پروتئین رسوب داده شده با در نظر گرفتن غلظت اسید، دما و زمان سپری شدن بین اضافه کردن اسید تا ایجاد رسوب پروتئین محاسبه می گردد.
جمع آوری نمونه
در این آزمایش می توان از ادرار بصورت انتخابی (Random) استفاده کرد ولی ادرار ۱۲ یا ۲۴ ساعته ترجیح داده می شود. البته نمونه ادرار ۱۲ یا ۲۴ ساعته باید بدون افزودن ماده نگهدارنده جمع آوری شده و در تمام مدت نمونه گیری، ظرف حاوی نمونه در محل خنک نگهداری شود. برای جمع آوری باید از ظرف تمیز و عاری از آلودگی استفاده نمود و به بیمار آموزش داده شود که برای جمع آوری ادرار ۲۴ ساعته، از ساعت ۸ صبح تا ۸ صبح روز بعد تمامی نمونه های پس از ساعت ۸ بطور کامل جمع آوری شده ولی ادرار ساعت ۸ صبح روز اول جمع آوری نگردد. باید توجه نمود که اگر اندازه گیری پروتئین ادرار در مدت ۴۸ ساعت پس از نمونه گیری انجام نمی شود، می توان نمونه را خوب مخلوط کرده و پس از تعیین حجم نمونه، بخشی از آن را تا روز انجام آزمایش در فریزر نگهداری نمود.
طرز تهیه TCA صد در صد ذخیره
به علت حالت خورندگی TCA باید تهیه محلول با احتیاط و با محافظت از چشمها و دستها انجام گیرد و پس از پایان کار ظروف مورد استفاده کاملاً شسته شوند.
۱۷۵ میلی لیتر آب مقطر دیونیزه شده را به یک ظرف حاوی ۵۰۰ گرم از TCA اضافه می کنیم. درب ظرف را بسته و به آرامی تکان می دهیم تا کاملاً حل شود. سپس تمام مواد را به طور کامل به یک بالن ۵۰۰ میلی لیتری منتقل می کنیم و حجم کل را به ۵۰۰ میلی لیتر می رسانیم. برای انحلال کامل طی مدت ۲۴ ساعت، محلول راگهگاه با عمل چرخش مخلوط می نمائیم.
محلول TCA صد درصد را در یک ظرف تیره و در دمای اتاق نگهداری می کنیم. این محلول برای ۱۲ ماه پایدار است.
طرز تهیه تری کلرواستیک اسید ۵/۱۲در صد (۷۶۵ میلی مول بر لیتر)
با استفاده از پیپت حجمی ۲۵ میلی متری، مقدار ۲۵میلی لیتر از محلول TCA۱۰۰درصد را به بالن ژوژه ۲۰۰ میلی لیتری منتقل می نماییم و با استفاده از آب مقطر حجم آن را به ۲۰۰ میلی لیتر می رسانیم. محلول حاصله را کاملا مخلوط کرده و در ظرف شیشه ای تیره در دمای اتاق نگهداری می نماییم. این محلول در دمای اتاق به مدت یک ماه پایدار است.
کنترل
از سرم کنترلهای تجاری به عنوان کنترل استفاده می گردد (رقتی برابر۳۰۰/۱ با استفاده از سرم فیزیولوژی تهیه می شود).
استاندارد
برای آزمایشهای روتین (روزانه) از سرم کنترلهایی ترجیحا با ارزش مرجع مانند precipath و Biorad و precinorm مشابه استفاده می شود. برای انجام کار ابتدا غلظت پروتئین این سرم کنترلها را به مقداری که امکان وجود آن در ادرار است می رسانیم. (برای رقیق کردن از سرم فیزیولوژی استفاده میشود)
لازم به ذکر است که این روش تا ۵۰۰ میلی گرم بر دسی لیتر خطی می باشد، بنابراین نمونه ها اعم از ادرار و استاندارد باید طوری رقیق شود که غلظت پروتئین موجود در آنها حداکثر ۵۰۰ میلی گرم بر دسی لیتر باشد.
توجه: از یک نوع نمونه کنترل نمی توان همزمان بعنوان کنترل و استاندارد استفاده نمود.
روش کار
۱) ۱۰ میلی لیتر از ادرار مورد آزمایش را سانتریفوژ نموده سپس با استفاده از نوار ادراری پروتئین آن را بررسی می کنیم و نتیجه را ثبت می نماییم. اگر غلظت پروتئین بیش از ۱+ بود نمونه ادرار را قبل از شروع آزمایش با سرم فیزیولوژی رقیق میکنیم. (نمونه های ۱+ تقریباً به نسبت ۵۰/۱ و نمونه های ۲+ تقریباً ۱۰/۱ و نمونه های ۳+ تقریباً ۱۵/۱ رقیق می شوند). اگر نیتریت ادرار مثبت باشد، می باید بیمار را برای نمونه گیری مجدد با رعایت شرایط نمونه گیری راهنمایی نموده و در صورت تکرار آلودگی نمونه، بیمار جهت مشاوره و لزوم بررسی نتایج کامل ادرار و احتمالاً درخواست کشت به پزشک معرفی گردد.
۲) برای هر آزمایش (نمونه، کنترل و استاندارد) دو لوله در نظر می گیریم (یکی به عنوان بلانک و دیگری به عنوان آزمایش)
۳) ۱/۶میلی لیتر از نمونه ادرار، استاندارد و کنترل را در لوله های مربوطه ریخته و سپس ۴/۰میلی لیتر از محلول TCA ۱۲/۵درصد به همه لوله ها اضافه می نماییم. و بعد به آرامی لوله ها را مخلوط می کنیم.
دما در این مرحله مؤثر بوده و می باید بین ۲۳ تا ۲۷ درجه سانتی گراد باشد.
لوله های بلانک را بعد از مدت ۲۰ دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۱۵۰۰ سانتریفوژ مینماییم.
لوله های آزمایش را بعد از ۳۵ دقیقه کاملاً مخلوط نموده و جذب نوری آنها را در طول موج ۴۰۵ یا ۴۵۰ نانومتر در مقابل مایع رویی بلانک مربوطه بدست می آوریم.
رعایت زمان ۳۵ دقیقه برای این آزمایش ضروری می باشد.
محاسبه
میلی گرم پروتئین در ادرار ۲۴ ساعته=
ضریب رقت نمونه × حجم ادرار ۲۴ ساعته (میلی لیتر) × F × جذب نوری آزمایش
F= حاصل تقسیم مقدار استاندارد بر جذب استاندارد
با توجه به توانائی این روش برای سنجش مقادیر کم پروتئین (حدود ۲۵ میلی گرم در لیتر پروتئین و بیشتر)، از این روش می توان برای غربالگری وضعیت کلیوی جمعیتهای مستعد به بیماری کلیوی مانند مبتلایان به دیابت در راستای بررسی میکروپروتئینوری استفاده نمود.
در افراد سالم مقدار دفع پروتئین تام تا ۱۵۰میلی گرم بر لیتر در ادرار طبیعی می باشد.
نکات قابل توجه
۱) کدورت حاصله از اضافه شدن TCA به ادرار به دلیل وجود آلبومین و گلبولین می باشد.
۲) هر نمونه باید در مقابل بلانک مربوط به خود اندازه گیری شود.
۳) PH قلیایی و پیگمانهای ادرار باعث ایجاد نتایج مثبت کاذب می شود.
۴) دفع پروتئین در ادرار به طور دائم ثابت و مشخص نمی باشد و در دوره های ۲۴ ساعته تغییر قابل ملاحظه ای دارد. بنابراین برای اندازه گیری پروتئین دفع شده بهتر است از ادرار ۲۴ ساعته استفاده نمود.
۵) ممکن است بین نتایج بدست آمده از روش کدورت سنجی TCA و بررسی ادرار توسط نوارهای ادراری تفاوت وجود داشته باشد. مشاهده نتایج منفی یا مقادیر کمی پروتئین با نوار ادراری و نتیجه مثبت با روش TCA به طور همزمان ممکن است به دلایل زیر باشد:
وجود پروتئین Myeloma (گاما گلبولین و پروتئین بنس جونز) در ادرار.
نمونه های غیر هموژن به علت استفاده از داروهای خاص مانند Tolmetin و داروهای ضدالتهاب که در درمان آرتریت روماتوئید استفاده می شود. متابولیتهای این داروها می تواند باعث ایجاد نتایج مثبت کاذب شود.
