تست dnase و ساخت محیط DNase Test Agar

–  هدف:
این محیط کشت در ارزیابی فعالیت دزوکسی ریبونوکلئاز (DNase) باکتری ها و قارچ ها و خصوصاً به عنوان کمک در تشخیص استافیلوکوک های بیماری زا بکار می رود.
with Toluidine  Blue Test Agar DNase برای کمک در تفکیک و تشخیص گونه سراشیای بدون پیگمان که ممکن است به اشتباه  بعنوان گونه انتروباکتر و کلبسیلا تشخیص داده شوند، به کار می رود.
 
۲-  اساس آزمایش:
اگر استافیلوکوک آنزیم DNase  داشته باشد این آنزیم، اسیدنوکلئیک را هیدرولیز می نماید که با استفاده از معرف و ایجاد هاله شفاف در اطراف محل رشد باکتری می توان به این موضوع پی برد.
ویژگی های آزمایش:
حساسیت: ۹۹% استافیلوکوک های کواگولاز مثبت،  DNase مثبت نیز هستند.
اختصاصیت:۲۰% استافیلوکوک های کواگولاز منفی، DNase مثبت هستند.
۳-  نمونه اولیه:
پلیت های LEMB Agar  یا Sheep Blood Trypticase Soy Agar with 5% حاوی
ارگانیسم مورد نظر
۴-  مواد و ابزار مورد نیاز: 

• پلیت Test Agar DNase
• معرف اسید کلریدریک ۱N (یک نرمال) یا معرف تولوئیدین بلو ۱/۰%

توجه : پلیت هایwith Toluidine  Blue  Test Agar DNase را می توان مستقیماً بدون افزودن معرف بررسی نمود، چون خود محیط کشت حاوی  g/lit 05/0 از ماده Toluidine Blue O     می باشد. مقدار این ماده در محیط کشت نباید از ۰۰۵/۰ %  تجاوز کند چون در غلظت های بالاتر ممکن است  شناسایی فعالیت DNase  را مشکل سازد.
۵-  روش انجام کار:
پلیت های  DNase Test Agar یاDNase Agar with Toluidine Blue  را با نمونه مورد نظر به صورت نقطه ای (یا خطی) تلقیح نمایید. پلیت ها را به مدت ۲۴-۱۸ ساعت در دمای^°۲ ± ۳۵ سانتی گراد انکوبه نمایید. پس از انکوباسیون، روی پلیت های DNase Test Agar  ساده، اسید کلریدریک ۱ نرمال و یا تولوئیدین بلو ۱/۰% بریزید به گونه ای که سطح پلیت را کاملاً بپوشاند و سپس آن را بر روی زمینه تیره قرار داده و بررسی نمایید. تلقیح باید نقطه ای باشد، چون بعضی از سویه های استافیلوکوک اورئوس به خوبی بر روی محیط، رشد نمی کنند و در نتیجه میزان رشد برای ارزیابی فعالیت DNase کافی نخواهد بود. در صورت تلقیح نقطه ای، حتی اگر در محل تلقیح، رشدی ایجاد نشود می توان فعالیت DNase را ارزیابی نمود.
 
–   DNase Test Agar که اسید کلریدریک یک  نرمال روی آن ریخته شده است .

1. a) مثبت : فوراً هاله های شفاف کاملاً مشخصی اطراف کلنی یا محل تلقیح را در محیط کشت احاطه می کنند.
2. b) منفی : اطراف کلنی ها یا محل تلقیح شفاف نمی شود.

 
– DNase Test Agar که تولوئیدین بلو ۱/۰% روی آن ریخته شده است :

1. a) مثبت: هاله های شفاف قرمز صورتی ،اطراف کلنی یا محل تلقیح را احاطه می کنند. محیط در جایی که DNA باقی مانده باشد آبی می شود.
2. b) منفی: هاله های کدر قرمز صورتی اطراف کلنی یا محل تلقیح را احاطه می کنند.

• پس از انکوباسیون روی پلیت هایDNase Test Agar With Toluidine Blue ، معرف ریخته نمی شود و مستقیماً بررسی می گردد.

1. مثبت (+): هاله شفاف قرمز صورتی واضحی اطراف کلنی یا محل تلقیح را در یک محیط آبی (نیلی) احاطه می کند.
2. منفی (-): بدون تغییر، محیط به رنگ آبی تیره شفاف باقی می ماند.

 
۶-   برنامه کنترل کیفی (QC):
 
:DNase Test Agar
Staphylococcus aureus ATCC 25923 : رشد متوسط تا زیاد، احاطه شده با هاله شفاف
صورتی تا قرمز (کنترل مثبت)
Staphylococcus Epidermidis ATCC 12228: رشد متوسط تا زیاد، بدون هاله (کنترل منفی)
DNase Test Agar with Toluidine Blue :
Klebsiella Pneumoniae ATCC  ۳۳۴۹۵ : رشد متوسط تا زیاد، بدون هاله (کنترل منفی)
Serratia  marcescens ATCC 13880: رشد متوسط تا زیاد، احاطه شده با هاله صورتی شفاف (کنترل مثبت)
۷-  تداخلات: 
بعضی از سویه های استافیلوکوک ممکن است روی DNase Test Medium with Toluidine Blue مهار شوند.
پروتئوس ولگاریس، سودوموناس آئروژینوزا و آئروموناس، واکنش های مثبت زیادی برای تولید DNase نشان می دهند.