رنگ آمیزی اسید – پایدار باکتری ها (Acid Fast Stain):
پل ارلیش(Paul Ehrlich) رنگ آمیزی اسید – پایدار (Acid Fast Stain) را در سال ۱۸۸۲ میلادی، به هنگام بررسی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس(Mycobacterium tuberculosis)عامل بیماری سل ابداع کرد. برخی از باکتری ها وقتی با کربول فوشین غلیظ همراه با حرارت رنگ آمیزی شوند و بعد برای رنگ بری در معرض اسیدهای قوی قرار گیرند رنگ خود را از دست نمی دهند و در برابر اسیدها مقاومند (اسید – فاست هستند). این پدیده اساس رنگ آمیزی اسید – فاست است که برای رنگ آمیزی باکتری های خانواده مایکوباکتریوم ها از جمله مایکوباکتریوم توبرکلوزیس بکار می رود. در این روش ابتدا گسترش را با کربول فوشین غلیظ و حرارت رنگ آمیزی می کنند سپس با اسید رنگ بری را انجام می دهند و پس از شستشو با آب، لام را با آبی متیلن رنگ آمیزی می نمایند. در این صورت کلیه باکتری ها به رنگ آبی در می آیند به استثناء مایکوباکتریوم ها که اسید – فاست بوده و رنگ قرمز مربوط به کربو فوشین را حفظ می کنند. مقاومت در برابر اسید در باکتری ها مربوط به وجود مواد چربی و موم موجود در دیواره است.
مایکوباکتریوم توبرکلوزیس نه تنها در مقابل اسید مقاوم است بلکه در مقابل الکل هم، مقاوم است. زمانی که در نمونه های آزمایشگاهی (خلط و ادرار) رنگ آمیزی را انجام می دهیم باید لام ها را با اسید و الکل رنگ بری کنیم چرا که با این عمل مایکوباکتریوم های ساپروفیت همچون مایکوباکتریوم اسمگماتیس(Mycobacterium Smegatis) که در مقابل الکل مقاوم نیستد باعث اشتباه نشوند.
وجود اسید میکولیک در دیواره سلولی و توانایی ترشح آن توسط باکتری، تنها در سه جنس از باکتری ها مشاهده شده که براساس آن نیز گروه CNM که شامل سه جنس کورینه باکتریوم، نوکاردیا و مایکوباکتریوم ها می باشد تعریف شده است. این سه جنس توانایی ترشح اسید میکولیک را داشته و درصد گوانین و سیتوزین آن ها نیز مشابه است.
| شکل۱۰ – شمای دیواره سلولی مایکوباکتریوم ها |
طول زنجیره کربنی اسید میکولیک در این سه جنس با هم متفاوت بوده به طوری که در مایکوباکتریوم ها بیشترین و در کورینه باکتریوم ها کمترین مقدار را دارا است. تفاوت هایی از این قبیل و هم چنین وجود سایر چربی ها در دیواره سلولی باعث خاصیت اسید – فاست در مایکوباکتریوم ها شده در حالی که کورینه باکتریوم، غیر اسید – فاست است. از لیپیدهای مهم دیواره مایکوباکتریوم توبرکلوزیس می توان به فاکتور طناب (ترهالوزدی میکولات)، میکوزیدها و سولفاتیدها و ترکیبی بنام موم(Wax) اشاره کرد.
مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل بیماری سل، ارگانیسمی باریک و بلند، خمیده و دارای انتهای برجسته، فاقد اسپور و کپسول است. این باکتری جزء باکتری های اسید – فاست بوده و رنگ آمیزی اختصاصی آن روش ذیل نلسون (Ziehl-Neelsen Method )است. ایجاد شکل تسبیح مانند این باکتری در زیر میکروسکوپ بدلیل وجود گرانول ها و واکوئل های حاوی فسفات است. دیواره سلولی از مهم ترین و شاخص ترین اجزاء مایکوباکتریوم ها محسوب می شود و در شکل دادن و حفظ تمامیت سلول و پایداری میکروب در میزبان ضروری است. دیواره سلولی چند لایه، ضخیم و نظر شیمیایی بسیار پیچیده است. بیش از ۶۰ درصد وزن آن را لیپیدها تشکیل می دهند. اجزاء اصلی لیپیدی آن اسید میکولیک می باشد که اسید چربی با زنجیره بلند بتا هیدروکسی بوده و دارای انشعاب می باشد. این اسید با ایجاد یک پیوند آب گریز، یک پوسته لیپیدی (سد لیپیدی) در اطراف باکتری ایجاد می کند. این لایه در نزدیکی لایه پپتیدوگلیکان قرار داشته و به صورت تک لایه می باشد که در واقع بخش داخلی لایه لیپیدی موجود در پوشش را تشکیل می دهد و کل سطح سلول را می پوشاند. این ترکیب به علت دارا بودن ساختمان کریستال مانند و لیپوئیدی خاصیت آب گریز به سطح سلول می دهد و در ایجاد مقاومت میکروب در برابر مواد شیمیایی موثر است.
اصولا ” مواد محلول چربی یا چربی دوست ها باید بتوانند از طریق حل شدن در غشای لیپیدی دو لایه از هر غشاء زیستی به راحتی عبور نمایند ولی وجود سیالیت اندک اسید میکولیک در دیواره مایکوباکتریوم تا حدود زیادی آزادی عمل را در انتشار به داخل سلول از این مواد نیز گرفته است. با توجه به آن که بخش عمده ای ای دیواره را چربی و به خصوص اسید میکولیک می سازد می تواند در ممانعت از نفوذ پذیری، نقش فعالی داشته باشد.
داروی ایزونیازید باعث توقف سنتز اسید میکولیک شده و باعث از بین رفتن خاصیت اسید فاست و حتی تغییر در رنگ پذیری باسیل سل می گردد. این دارو در غلظت های بالا اثر مهارکنندگی قوی بر رشد اکثر سویه های مایکوباکتریوم دارد ولی در غلظت های پایین می تواند باعث تغییر در دیواره سلول گردد. کاهش ۲۰ درصدی تولید اسید میکولیک از جمله این تغییرات است که باعث نفوذپذیری بیشتر سلول می شود.
اسید میکولیک نه تنها در مقابل ورود مواد غذایی مانع ایجاد می کند. بلکه از خروج پروتئین های ترشحی و دفعی مایکوباکتریوم ها نیز ممانعت بعمل می آورد. افزودن پنج درصد اتانول به محیط کشت لولون اشتاین که محیط کشت مخصوص مایکوباکتریوم توبرکلوزیس است می تواند رشد باکتری را چند روز تسریع نماید. این امر می تواند به علت ایجاد منافذی با قطر مناسب در دیواره چند لایه این باکتری باشد. که راه را برای ورود مواد غذایی و اکسیژن همواره می نماید. یکی از راه های ارزان قیمت برای کاهش زمان ظهور کلنی و تقویت رشد مایکوباکتریوم توبرکلوزیس استفاده از محیط حاوی غلظت مناسب و پایین یک ماده افزاینده نفوذ پذیری دیواره سلولی است تا به این طریق بر مشکل کندی رشد این باکتری غلبه نمود.
كورينه باكتريوم، گوردونيا، نوكارديا، رودوكوك و مايكو باكتريوم در دیواره سلولی خودشان داراي اسيد مايكوليك می باشند لذا برا رنگ آمیزی آنها از روشهای اسید – پایدار(Acid –Fast) استفاده می شود. البته باتوجه به اینکه مقداراسيد مايكوليك در انها متفاوت است لذا میزان اسید در معرف رنگ بر در انها فرق می کند و به غیر مايكوباكتريومها که میزان اسيد مايكوليك آنها زیاد است مابقی با رنگ آمیزی گرم رنگ می گیرند.
رنگ آمیزی اسید – پایدار به روش ذیل نلسون(Ziehl_Neelsen Method ):
طرزتهيه رنگ ها و محلول ها:
- محلول كربول فوشين:
الف) محلول فوشين بازيك، ۳/۰ گرم از فوشين بازيك را در ۱۰ میلی لیتر اتانول ۹۵ % حل مي كنیم.
Basic fuchsin ۰٫۳ g
Ethanol 95% ۱۰ ml
ب) محلول فنل، مقدار ۵ گرم از فنل كريستاله را كمي گرم مي كنیم تا ذوب شود. سپس با اضافه كردن آب مقطر حجم نهايي آن را به ۹۰میلی لیتر مي رسانیم.
Phenol crystals ۵ g
Distilled water ۹۰ ml
براي تهيه محلول كربول فوشين، مقدار ۱۰ میلی لیتر از محلول فوشين بازيك را به ۹۰ میلی لیتر از محلول فنل اضافه مي نمايیم.
- محلول رنگ بر
براي آماده كردن اسيد الكل ۳ % ، مقدار ۳ میلی لیتر از اسيد كلريدريك غليظ را در ۹۷ میلی لیتر از اتانول حل مي كنیم.
Ethanol 95% ۹۷ ml
HCl ۳ ml
در زیر هود شیمیایی، به آرامي اسيد را به ظرف الكل اضافه مي نمايند. براي رنگ بري مي توان از اسيد سولفوريك ۲۵ % نيز استفاده كرد (۲۵میلی لیتر اسيد + ۷۵ میلی لیتر آب مقطر).
- محلول رنگ آميزي زمينه
مقدار ۳/۰ گرم از آبي متيلن را در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل مي كنیم.
Methylene blue ۰٫۳ g
Distilled water ۱۰۰ ml
روش کار:
- با رعایت شرایط سترون، چندین گسترشی مخلوط از باسیل کالمت –گرین(Bacille Calmatte Guerin) و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس تهیه نموده، پس از خشک شدن با حرارت آنها را ثابت نمایید.
- لام ها را بر روی یک پایه فلزی قرار می دهیم. لام ها نباید با یکدیگر تماس داشته باشند. تمام سطح گسترش را با محلول کربول فوشین صاف شده می پوشانیم.
- لام ها را به آرامی حرارت می دهیم تا هنگامی که بخار متصاعد گردد (حرارت ملایم و متناوب به مدت ۵-۳ دقیقه). به هنگام حرارت دادن باید از جوشاندن فوشین یا خشک شدن سطح لام جلوگیری کرد.
- هر لام به آرامی شسته می شود تا زمانی که رنگ آن پاک شود.
- تمام سطح گسترش را با محلول رنگ بر (اسید – الکل ۳%) برای حداکثر ۳ دقیقه می پوشانیم.
- لام ها را به آرامی می شوئیم.جریان آب نباید در حدی باشد که گسترده از روی لام کنده شود.
- تمام گسترش را با رنگ زمینه (متیلن بلو) به مدت ۲ دقیقه می پوشانیم.
- سطح لام را به آرامی با آب شسته،لام را کمی می چرخانیم تا آب اضافی آن ریخته شود.سپس می گذاریم لام در درجه حرارت اتاق خشک شود.
- با عدسی ۱۰۰ میکروسکوپ و روغن ایمرسیون مشاهده می کنیم.
باکتری های اسید – فاست قرمز رنگ و سایر باکتری ها به رنگ آبی مشاهده می شوند.
بررسي گسترش ها ی تهیه شده از نمونه های بیماران باید در نهايت آرامش و با دقت انجام گیرد ومناسب ترين ميدان محلی از لام است که لوكوسيت، موكوس و سلول هاي مژك دار در انجا وجود دارد و باسيل ها ممكن است: بصورت منفرد، دوتايي يا دسته جمعي دیده شوند براي گزارش نتيجه منفي، بررسي حداقل ۱۰۰ ميدان ميكروسكوپي لازم است.
گزارش نتايج آزمايش ميكروسكوپي در رنگ آميزي با ذِیل نلسون با عدسی ۱۰۰(بزرگنمایی ۱۰۰۰) مطابق جدول شماره ۲ می باشد.
| گزارش نتايج | تعداد باسيل مشاهده شده |
| منفي | در ۱۰۰ میدان باسيلی مشاهده نشد |
| تعداد باسیل در میدان | ۱-۹ عدد باسیل در ۱۰۰ میدان |
| + | ۱۰-۹۹ عدد باسیل در ۱۰۰ میدان |
| ++ | ۱-۱۰ عدد باسیل در هر میدان |
| +++ | بیش از ۱۰عدد باسیل در هر میدان |
| جدول ۲- گزارش نتايج آزمايش ميكروسكوپي در رنگ آميزي ذِیل -نلسون |
بدلیل اینکه تعداد باسيل هاي دفع شده، هميشه يكسان نيست. بنابراين براي بالا بردن امكان مشاهده باسيل و قطعي شدن تشخيص، سعي بر اين است تا حداقل ۳ نمونه دريافت شود. ممكن است فقط در يك نمونه از ۳ نمونه صبحگاهي بيمار، باسيل هاي اسيد فست وجود داشته باشد.
- این رنگ آمیزی برای شناسایی و بررسی باکتری های اسید – پایدار(Acid-Fast)همچون مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل بیماری سل و مایکوباکتریوم لپره عامل بیماری جذام مورد استفاده قرار می گیرند.
- برخی از گونه های جنس نوکاردیا، اسید – فاست نسبی هستند.
- اسپور باکتری ها در رنگ آمیزی اسید – فاست به رنگ قرمز مشاهده می شود.
