الایزا (روش کار،انواع،انجام تستهای هورمونی به روش الایزا)

تست الایزا(ELISA)‏ روشی عمومی در بیوشیمی غربالگری است.تست الیزا در اصل برای کنترل کیفیت در گیاه‌پزشکی بوجود آمد و سپس به عنوان روش تشخیص آزمایشگاهی در برخی بیماری‌های انسان بکار گرفته شد.

 الایزا یک آزمایش استاندارد برای کشف ویروس در خون است و استانداردی جهانی برای استفاده در بیمارستان‌ها٬ بانک خون و سازمان‌های انتقال خون بویژه در تشخیص ایدز می‌باشد.

 در الایزا خود ویروس جستجو نمی‌شود بلکه میزان آنتی‌بادی که در بدن شخص آلوده به یک ویروس(مانند HIV) تولید شده٬ اندازه گرفته می شود.

تست الایزا یک آزمایش ارزان و نسبتاً دقیق است و در آن یک نمونه خونی گرفته شده و در دور بالا سانتریفوژ می‌شود. پس از جداسازی سرم خون از ذرات٬ یک ماده معرف(بسته به ویروس مورد ردیابی) به سرم خون اضافه می‌شود که محلول را رنگی می‌کند و وجود پادتن‌های ضد ویروس موردنظر را مشخص می سازد.غالباً برای جلوگیری از نتایج مثبت کاذب در الیزا٬ پس از مثبت شدن الیزا از تست وسترن بلات برای تأیید استفاده می‌شود.

انواع روشهای الایزا

امروزه بر حسب اینکه ماهیت آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی مورد سنجش چگونه است و چه هدف کلی از انجام تست الایزا داریم؟وچه مواد و چه واکنشگرهایی در اختیار داریم و یا قادریم تهیه کنیم،روشهای مختلفی از آزمونهای الایزا طراحی شده و به وفور در کیت‌های تشخیص پاتوژنها و در آزمایشهای تحقیقاتی مورد استفاده قرار می‌گیرند. این روشها در زیر مورد بررسی قرار می‌گیرند:

الایزای مستقیم

 الایزای مستقیم براساس جذب یا پوشش‌دهی آنتی‌ژن

 ‌الایزای مستقیم براساس جذب یا پوشش‌دهی آنتی‌بادی

الایزای غیر مستقیم

الایزای ساندویچ

 ساندویچ مستقیم

 ساندویچ غیر مستقیم

الایزای رقابتی یا مهاری

 روش سنجش رقابتی یا مهاری برای آنتی ژن

 روش رقابتی برای آنتی بادی

برای انجام تست الایزا از پلیتهایی استفاده میکنیم که دارای تعدادی میکروچاهک هستند

الایزای مستقیم

براساس جذب یا پوشش‌دهی آنتی‌بادی

 این روش دارای ۷مرحله می باشد:

-پوشش‌دهی آنتی بادی بر روی پلیت‌ها

– شستشو

– افزودن کونژوگه (آنتی‌بادی اتصال یافته با آنزیم)

 -گذراندن زمان انکوباسیون

– شستشو

– افزودن سیستم رنگی و stop

 -قرائت پلیت با الایزاریدر.

 این نوع روش الایزا نیز فقط در موارد مشخصی استفاده می‌شود. کلا آنتی‌ژن در موارد بسیار معدودی کونژوگه می‌شود و استفاده از این روش بستگی به نوع کار تحقیقاتی دارد.

الایزای غیر مستقیم

این روش دارای ۱۰مرحله می باشد:

-پوشش‌دهی آنتی‌ژن

– شستشو

 -افزودن آنتی‌بادی (علیه آنتی‌ژن پوشش داده شده)

– گذراندن زمان انکوباسیون

– شستشو

– افزودن کونژوگه (آنتی‌بادی ثانویه همراه با آنزیم علیه آنتی‌بادی اولیه)

– گذراندن زمان انکوباسیون

 -شستشو

– افزودن سیستم رنگی و stop

– قرائت پلیت با الایزاریدر

این روش بسیار رایج می‌باشد و معمولا برای مشخص نمودن آنتی‌بادی علیه یک پاتوژن خاص یا علیه یک ماده خاص درون سرم از این روش استفاده می‌شود.

ویژگی اندازه‌گیری بستگی به  خلوص آنتی‌ژنی متصل شده به پلیت دارد. در این روش سرم  می‌تواند حاوی آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن باشد (مثلا در افراد مبتلا به بیماری که بدنشان علیه پروتئین‌های آنتی ژنی یک پاتوژن آنتی‌بادی ساخته است) و می‌تواند آنتی‌بادی علیه آن آنتی‌ژن نداشته باشد (افراد سالم).

 در این روش در مراحل اولیه و تنظیم تست الایزا، می‌توان سرم را با رقت‌های مختلف اضافه کرد (سرم را می‌توانیم با محلول رقیق کننده سرم رقیق کنیم) و بهترین رقت را در تست‌های الایزای موازی که فقط رقت سرم آنها متفاوت است بدست آورد. این روش در کیت‌های تجاری تشخیص بیماریها به وفور استفاده می‌شود.

الایزای مستقیم (DIRECT ELISA)

در این روش آنتی‏ ژن یا آنتی‏ بادی موجود در نمونه ه‏ایی که باید تشخیص داده شود به طور مستقیم بر سطح فاز جامد کوت می‏شود و سپس آنتی‏ بادی یا آنتی ژن مکمل آن که نشاندار شده است به سیستم اضافه می‏شود.

 در صورت وجود آنتی‏ ژن یا آنتی‏ بادی مورد نظر در نمونه، سیگنال مناسب ایجاد می‏شود. این کاربرد چندانی در کیت‏های تشخیصی ندارد و بیشتر در کارهای تحقیقاتی استفاده می‏شود.

الایزای غیر مستقیم (INDIRESITI ELISA)

این روش برای تعیین آنتی‏ بادی اختصاصی و یا تیتراسیون آنتی‏ بادی در نمونه ‏های سرم مورد استفاده قرار می‏گیرد.

اساس آزمایش بدین نحو است که معمولا سرم رقیق شده به آنتی‏ ژن‏های کوت شده در فاز جامد (میکرو ول یا چاهک) اضافه می‏شود.

 آنتی‏ ژن کوت شده آنتی‏ ژن اختصاصی مربوط به آنتی‏ بادی است که قرار است در نمونه ردیابی شود.

 پس از افزودن نمونه و طی زمان انکوباسیون و یک مرحله شستشو آنتی‏ هیومن گلوبولین نشاندار شده با آنزیم به چاهک اضافه می‏شود.

بر حسب اینکه چه کلاسی از آنتی‏ بادی برای ردیابی اهمیت دارد نوع آنتی Ig مورد استفاده نیز متفاوت است مثلا برای ردیابی آنتی‏ بادی کلاس IgG از آنتی‏ هیومن IgG و برای ردیابی کلاس IgA از آنتی‏ هیومن IgA استفاده می‏شود.

 اختصاصیت سنجش مستقیما توسط آنتی‏ ژن کوت شده در فاز جامد تعیین می‏شود که ممکن است کاملا خالص و اختصاصی باشد و یا نسبتا خام و غیراختصاصی باشد.

بهترین مثالها در مورد این روش تعیین آنتی‏ بادی بر علیه توکسوپلاسما، روبلا، ویروس سیتومگال و هلیکوباکترپیلوری از کلاسهای IgM و IgA و IgG در سرم می‏باشد.

الایزای ساندویچ

الایزای ساندویچ به دو روش الایزای مستقیم و الایزای غیرمستقیم تقسیم می شود:

 ساندویچ مستقیم

 این روش دارای ۹مرحله می باشد:

-پوشش‌دهی آنتی ‌بادی

 -شستشو

 -افزودن آنتی‌ژن

– گذراندن زمان انکوباسیون

 -شستشو

 -افزودن آنتی‌بادی کونژوگه شده با آنزیم

– گذراندن زمان انکوباسیون

– افزودن سیستم رنگی

– قرائت پلیت توسط الایزاریدر

دو آنتی‌بادی که در این سیستم بکار می‌روند می ‌توانند هر دو از یک گونه باشند و یا می ‌توانند از گونه‌های متفاوتی از موجودات بدست آیند.

 گاهی اوقات به آنتی ژ‌نی که در این سیستم بکار می‌رود آنتی ژن تسخیر شده یا به دام افتاده می‌گویند.

 در این روش استفاده از محلولهای بلوکه کننده یا افزودن محلولهای بلوکه کننده به محلول پوشش‌دهی و محلولهای شستشو بسیار مهم است.

نکته مهم

 در این روش باید بدانیم که آنتی‌ژن ما حداقل دو محل اتصال به آنتی ‌بادی داشته باشد تا بتواند به این آنتی‌بادی ‌ها متصل شود مثال های بارز این روش اندازه گیری ،TSH  ، LH ،  FSH ،PSA ، HCG و …میباشند

ساندویچ غیر مستقیم

این روش دارای ۱۰رحله می باشد:

 -پوشش‌دهی آنتی ‌بادی

 -شستشو

– افزودن آنتی ‌ژن

 -گذراندن زمان انکوباسیون

 -شستشو

– افزودن آنتیی ‌بادی علیه آنتی‌ژن

 -شستشو

 -افزودن آنتی‌بادی سوم کونژوگه شده با آنزیم (علیه آنتی ‌بادی دوم)

 -شستشو

 -قرائت پلیت توسط الایزاریدر

 مشخص است که آنتی ‌بادی  دوم  باید از یک گونه متفاوت از موجودات تهیه شود مثال بارز این روش کیت اندازه گیری آنتی بادی بر علیه پلاسمودیوم ویواکس و ترپونما پالیدوم و HBsAb می باشد.

الایزای رقابتی یا مهاری

 در روش های رقابتی اساس سنجش بر رقابت دو آنتی ژن یا دو آنتی بادی ( که یکی از آن دو با آنزیم نشاندار شده است ) برای اتصال لیگاند با مقدار محدود استوار است.

اگر هردو آنالیت نشاندار و غیر نشاندار با هم به سیستم اضافه شوند روش را رقابتی می نامند ولی چنانچه ابتدا آنالیت اضافه شده و پس از یک دوره انکوباسیون آنالیت نشاندار اضافه گردد روش را مهاری یا بلاکینگ می نامند .

در روش مهاری ممکن است در بین دو مرحله و قبل از اضافه نمودن آنالیت بعدی شستشو انجام شود یا انجام نشود ، مثال بارز روش های رقابتی و مهاری سنجش T4 و T3 می باشد .انواع روش های رقابتی عبارتند از :

روش سنجش رقابتی یا مهاری برای آنتی ژن :

اساس این روش بر رقابت بین آنتی ژن نشاندار و آنتی ژن موجود در نمونه برای اتصال به یک آنتی بادی اختصاصی کوت شده در چاهک استوار است .

در این روش مقدار آنتی بادی کوت شده باید محدود باشد و ملکول سیگنال دهنده همان آنتی ژن نشاندار است ، اساس روش RIA(نشاندار کردن با رادیواکتیو) و EIA (نشاندار کردن با آنزیم)کلاسیک همین روش است .در این روش منحنی پاسخ دوز به صورت معکوس خواهد بود ،  بدین معنی که آنالیت نشاندار در حضور مقادیر زیادی از آنالیت غیر نشاندار موجود در نمونه کمتر به آنتی بادی متصل می شود و در نتیجه سیگنال کمتری هم وجود خواهد آمد .

در برخی از موارد نشاندار کردن روی خصوصیات هاپتن اثر می گذارد در نتیجه در روش رقابتی برای تعیین آنتی ژن از یک آنتی بادی نشاندار استفاده می شود ، در این سنجش ها این مطلب ضروری است که فاز جامد توسط آنتی ژن با مقدار کم و ثابت پوشیده می شود ، در این روش آنالیت موجود در نمونه با آنالیت کوت شده در چاهک برای اتصال به آنتی بادی نشاندار رقابت می کند . در اینجا هم منحنی استاندارد معکوس است ، از این روش بیشتر برای سنجش ایمنی به روش کمی،لومینسانس استفاده می شود .

روش رقابتی برای آنتی بادی :

 در این روش رقابت بین دو آنتی بادی یکی در نمونه به صورت غیر نشاندار و یکی به صورت نشاندار شده با آنزیم برای اتصال به یک آنتی ژن کوت شده در چاهک صورت می پذیرد ، بدیهی است که هر چه مقدار آنتی بادی نمونه بیشتر باشد آنتی بادی نشاندار کمتری به چاهک ها متصل شده و سیگنال نیز کمتر خواهد بود و در نتیجه منحنی استاندارد نیز معکوس می باشد ، شاخص ترین مثال برای این روش اندازه گیری آنتی بادی بر ضد HBc (هپاتیت B)است .

نکات مهم در انجام تست های هورمونی به روش الایزا

تقریباً برای تمامی سنجش های ایمنی از سرم به عنوان نمونه استفاده می کنیم. اما گاهی ممکن است فردی که ازمایش را انجام میدهد، به دلایلی نظیر کافی نبودن میزان سرم یا پرهیز از نمونه گیری مجدد از نمونه پلاسما برای سنجش یک آنالیت استفاده کند…

 در این طور موارد باید بروشور کیت به دقت بررسی شود به ویژه اگر در کیت استفاده از پلاسما نیز توصیه شده باشد باید مشخص شود که از چه نوع ماده ضد انعقادی می توان برای بدست آوردن پلاسما استفاده کرد.

 برخی از ضد انعقاد ها بر سنجش ازمایش ما تاثیر بدی دارند…

 برای مثال در استفاده از پلاسمایی که از EDTA  به عنوان ضد انعقاد استفاده شده است باید با احتیاط برخورد شود.

در هنگام گرفتن نمونه باید توجه داشت که طولانی بستن گارو(تورنیکه)ممکن است منجر به تغییر در پروتئین های حامل خون شود که این مسئله در سنجش برخی از آنالیتها تاثیر میگذارد.

 گاهاً لیپمی در سنجش برخی آنالیتها تداخل ایجاد میکند_ بویژه زمانی که آنالیت مورد سنجش یک مولکول آب گریز است…

 در زمان جداسازی سرم از لخته باید از ایجاد همولیز اجتناب شود چرا که همولیز می تواند عامله مداخله گر در سنجش های ایمنی آنزیمی باشد.

همولیز به ویژه در سنجش هورمون T4 آزاد (FREE T4) اثر دارد و سنجش آنرا بصورت کاذب کاهش می دهد.اکثر آنالیتهای قابل اندازه گیری با روش سنجش ایمنی آنزیمی تا حدودی در دمای اتاق و یخچال (۸-۲درجه) پایدار هستند با این حال اغلب آنالیتها نظیرPRL,FSH,LH,T3,T4,TSH در درجه حرارت یخچال تا یک هفته و در فریزر ۲۰- درجه تا چندین ماه پایدار می مانند.

 از دوباره ذوب و فریز نمونه باید پرهیز شود اما برخی آنالیتها نسبت به فریز و ذوب شدن مجدد مقاوم هستند مثلاً پروژسترون کاهش یک درصدی را در هر بار فریز یا ذوب شدن نشان  می دهد.

کیت یعنی مواد و محلولهایی که برای انجام ازمایشات مورد استفاده قرار میگیرند.

 کیت مورد نظر برای انجام تستهای مختلف به روش الایزا باید از شرکت معتبر دارای تاییدیه از یکی از مراجع بین المللی با بسته بندی مناسب و حاوی کنترل مثبت و منفی باشد.

رعایت زنجیره سرد (۸-۲ درجه) در حمل و نقل کیت از مبدا به مقصد (مصرف کننده) الزامی است.

 برای روش الایزا محلولهای مختلفی در کیت مورد نظر وجود دارد:

 -محلول های استاندارد با غلظتهای مختلف

 -محلول کنترل

 -محلول شستشو

 -محلول کروموژن

 -محلول کونژوگه

 -محلول متوقف کننده

آماده سازی محلول کونژوگه و یا سوبسترا بایستی توسط ابزار های حجمی و سمپلرهایی که در فواصل زمانی مناسب کالیبره شده و دارای صحت و دقت قابل قبول باشد صورت گیرد.

 در تهیه محلول ها باید از آب مقطر تازه متناسب با درجه توصیه شده در بروشور کیت استفاده گردد.آماده سازی بافر یا محلول شستشو هر بار بایستی به حد نیاز مصرفی باشد.

 تهیه بیش از حد محلول بافر و ماندن بافر در محیط آزمایشگاه منجر به آلودگی قارچی یا باکتریال آن میگردد مگرآنکه طبق دستورالعمل کیت مدت زمان نگهداری آن در دمای ۶-۲ سانتیگراد و  یا  اتاق تعریف شده باشد.

 نوک سمپلر ها و لوله آزمایش جهت تستهای الایزا بایستی تمیز و عاری از مواد شوینده باشد که این امر به جهت ممانعت از دخالت مواد شیمیایی در واکنش های آنزیمی می باشد.

 بهترین لوله ، جهت سوبسترا لوله شیشه ای است که با اسید سولفوریک رقیق شسته و با آب مقطر آبکشی شده باشد. سوبسترا باید دور از نور تهیه و نگهداری شود.

جهت انجام تستهای هورمونی

آماده سازی کیت :

 محلول های استاندارد و کنترل موجود در کیت را باید قبل از مصرف به آرامی تکان داد تا کاملا یکنواخت شود.

 در ضمن لازم است تا به تعادل دمایی با محیط برسد.اجزاء کیت مخصوصا کونژوگه ، سوبسترا و کروموژن بایستی بلافاصله پس از استفاده به یخچال منتقل گردد.

 این امر منجر به افزایش پایداری کیت می گردد به عبارتی تنها محلولی که تا پایان کار روی میز باقی می ماند محلول متوقف کننده واکنش (stopping solution )   می باشد.

انتقال استریپ های باقیمانده بداخل کیسه مخصوص نگهداری آن جهت جلوگیری از ورورد گرد و غبار و رطوبت به محیط عمل استریپها لازم است.

باید درب کیسه محکم بسته شده و در صورت در دسترس بودن بسته های رطوبت گیر از آنها استفاده شود.

 به تعادل دمایی رسیدن اجزای کیت با دمای محیط آزمایشگاه پس از خروج آن از یخچال ضروری است. زیرا دمای پایین می تواند باعث تغییر در میزان جذب نوری شود.

 بررسی ماکروسکوپی کلیه اجزاء کیت قبلا از مصرف به لحاظ وجود کدورت ، آلودگی قارچی و ذرات خارجی الزامی است.

محلول کروموژن که قبل از مصرف تغییر رنگ داده باشد احتمالا آلوده و فاسد شده است.قبل از هر مرحله مطابق دستورات کیت آماده سازی معرفها بایستی با دقت کافی صورت پذیرد.

 جهت کنترل کیفی و اطمینان از سالم بودن سوبسترا و کونژوگه حجمهای برابر از کونژوگه و سوبسترا را با هم مخلوط کنید. در این حالت رنگ حاصل باید به سرعت ظاهر گردد.

 برخورد نوک سمپلر آلوده با سوبسترا و یا بازماندن طولانی مدت درب ظرف سوبسترا می تواند منجر به آلودگی قارچی یا باکتریال سوبسترا گردد.

 محلول سوبسترا باید طبق دستورالعمل کیت تهیه و تا زمانی که دردستورالعمل ذکر شده قابل نگهداری در شرایط مطلوب می باشد و پس از آن لازم است مجدداً بصورت تازه تهیه گردد.

 به هنگام ریختن کنترلها در چاهکهای میکروپلیت به جهت جلوگیری از آلودگی چاهک به چاهک همیشه بایستی ابتدا کنترل منفی و سپس کنترل مثبت را اضافه کرد.

اطمینان از صحت کارکرد دستگاهها و تجهیزات مورد مصرف در روش دستی ، نیمه اتوماتیک و تمام اتوماتیک. بطور مثال برای اطمینان از صحت طول موج فیلتر های الایزا ریدر می توان از میکروپلیت های خاص که جهت کالیبراسیون تهیه شده اند و از برنامه های نرم افزاری مربوط به آن استفاده کرد.

مرحله شستشو (WASHING)

 مرحله شستشو یکی از مراحل مورد نیازبرای انجام تستهای هورمونی به روش الایزا میباشد.این امر باید توسط دستگاه الایزا واشر صورت گیرد…محلول شستشو یک نوع بافر میباشد.

 فشار بالای شستشو در روش دستی ناشی از تخلیه سریع بافر می تواند منجر به جداسازی و حذف اتصالات اختصاصی از کف چاهک و کاهش OD  کاذب گردد.

 فشار پایین شستشو به علت تخلیه آهسته بافر در روش های دستی می تواند منجر به عدم دفع کامل اتصالات غیر اختصاصی و افزایش کاذب جذب نوری گردد.

 در نظر گرفتن زمان خیس خوردن چاهک در فواصل شستشو (ریختن بافر و تخلیه) طبق دستورالعمل کیت الزامی است و معمولاً بین ۲۰ تا ۴۰ ثانیه است.

 این مرحله به جداسازی و دفع کامل اتصالات غیر اختصاصی کمک می کند.

 برای شستشو به روش دستی (با سمپلر) جهت جلوگیری از آسیب فیزیکی به چاهکها و جداسازی کمپلکس های پوشیده شده در کف چاهک سعی کنید تخلیه نمونه به طور مایل صورت گیرد.

 قبل از هر چیز به روش تهیه محلول شستشو در بروشور کیت توجه شود ، تهیه محلول شستشو غلیظ تر از حد توصیه شده منجر به تخریب و جدا شدن مولکولهای اتصال یافته می شود و جذب نوری کاهش می یابد.

نکات مهم در مورد میکروپلیت

 پس از خارج کردن پلیت از یخچال ممکن است بر سطح چاهکها بخار تشکیل شود که پایداری پلیت را کاهش می دهد ، بنابراین توصیه میشود که تا قبل از رسیدن دمای پلیت به دمای اتاق آنرا از کیسه مخصوص نگهداری پلیت خارج نکنید.

پس از استفاده از پلیت باقیمانده چاهکها را سریعاً به یخچال منتقل نمایید و دقت نمایید که در کیسه مخصوص پلیت نمگیر وجود داشته باشد.

 در مرحله انکوباسیون سوبسترای TMB به هیچ وجه از فویل،برای پوشاندن سطح پلیت استفاده ننمایید.

 نکات مهم در مورد محلول سوبسترای کونژوگه آنزیمی

از مخلوط کردن دو سوبسترا یا دو کونژوگه آنزیمی از دو سری ساخت با شماره های مختلف اجتناب کنید.

 برای تعیین کارایی کونوژوگه پراکسیداز و سوبسترای TMB به ترتیب زیر عمل کنید:

 به دو لوله تمیز مقدار ۲۰۰ لاندا از سوبسترای آماده اضافه نمایید.

در مورد TMB این سوبسترا باید شفاف و بدون رنگ باشد.

 به یکی از لوله ها ۱۰ لاندا از کونژوگه آماده اضافه نمایید که پس از چند دقیقه رنگ آبی حاصل می شود.

 به همان لوله ۱۰۰ لاندا محلول متوقف کننده اضافه کنید رنگ آبی به زرد تبدیل می شود.

به لوله دوم که حاوی ۲۰۰ لاندا محلول سوبسترا است ۱۰۰ لاندا  محلول متوقف کننده اضافه نمایید. هیچ گونه تغییر رنگی نباید حاصل شود.

 در صورتی که مواردی غیر از این موارد ذکر شده مشاهده شد با تولید کننده کیت تماس حاصل نمایید.

 در مقابل کاهش توانایی محلول شستشو به دلیل رقیق سازی زیاد باعث عدم جدا شدن اتصالات غیر اختصاصی و ایجاد جذب زمینه ای بالا می شود.

 مرحله شستشو باید حداقل سه بار برای هر چاهک انجام شود. در آخرین مرحله شستشو و پس از خروج کامل محلول از چاهک با برگرداندن پلیت باید محلول اضافی داخل چاهک را با کوبیدن بر سطح یک کاغذ یا دستمال نمگیر خالی نمائید.

 در هنگام شستشوی چاهک باید اطمینان حاصل کرد که محلول شستشو تمام چاهک ها را پوشانده است. از سر ریز شدن محلول چاهکها باید اجتناب شود.

در برخی روش های شستشو ، برای شستشوی بهتر یک زمان انتظار بنام soak time ذکر میشود. بدین ترتیب که پس از ریختن محلول درون چاهک ها مدتی صبر کرده و بعد چاهک را خالی می کنیم. این زمان از ۳۰ ثانیه تا چند دقیقه متغیر است.

 در صورتیکه این زمان توصیه شده باشد باید حتماً رعایت گردد.بدلیل اینکه در محلول شستشو از دترژنت استفاده میشود.

 درهنگام تهیه محلول شستشوی آماده کار ممکن است کف یا حباب ایجاد شود. از وارد شدن حباب یا کف به داخل چاهک باید جلوگیری شود. چون این حباب سطح تماس محلول را با چاهک کم نموده و اثرات شستشو را کاهش می دهند.

 قبل از شروع عملیات شستشو پیشنهاد می شود که pH آب مقطر که برای رقیق کردن محلول استفاده می شود و نیز pH محلول شستشوی آماده کار چک شود.

 در صورتیکه pH محلول شستشو بسیار اسیدی یا قلیایی باشد بر سنجش تاثیر می گذارد.محلول آماده کار برای شستشو باید بطور تازه تهیه و حتماً بر روی ظرف آن تاریخ ساخت قید شود.

الایزا به علت حساسیت زیادی که به محیط و هم چنین خطاهای کاربری دارد تستی است که نیازمند دقت و حساسیت بیشتری است.

 گاهی این خطاها ناشی از خود ما و یا گاهی ناشی از ریجنت ها و موادی هست که برای این منظور مورد استفاده قرار می دهیم.

 بیشترین میزان خطا در الایزا مربوط به تکنیسن است چون تست در حد میکرولیتری و حجم کم انجام می گیرد.

 همه خطاهای الایزا مربوط به اپراتور نیست و محلول هاو همچنین موادی که در الایزا مورد استفاده قرار می گیرند گاهی باعث خطا می شوند.

 آلودگی سر پیپت ها و همچنین ریجنت ها با میکروارگانیسم ها یکی از این دلایل است.

 یکی از خطاهای رایج انتخاب طول موج اشتباه است! اگر چاهک دارای رنگ شدید یا متوسطی باشد ولی میزان OD آن کمتر از یک باشد باید طول موج بررسی شود.

 برای کارهای حساس الایزا بهتر است که از آب سه بار مقطر شده استفاده شود.