روش انجام تست dnase و ساخت محيط DNase Test Agar

 
۱–  هدف:
اين محيط كشت در ارزيابي فعاليت دزوكسي ريبونوكلئاز (DNase) باكتري ها و قارچ ها و خصوصاً به عنوان كمك در تشخيص استافيلوكوك هاي بيماري زا بكار مي رود.
with Toluidine  Blue Test Agar DNase براي كمك در تفكيك و تشخيص گونه سراشياي بدون پيگمان كه ممكن است به اشتباه  بعنوان گونه انتروباكتر و كلبسيلا تشخيص داده شوند، به كار مي رود.
 
۲-  اساس آزمايش:
اگر استافيلوكوك آنزيم DNase  داشته باشد اين آنزيم، اسيدنوكلئيك را هيدروليز مي نمايد كه با استفاده از معرف و ايجاد هاله شفاف در اطراف محل رشد باكتري مي توان به اين موضوع پي برد.
ويژگي هاي آزمايش:
حساسيت: ۹۹% استافيلوكوك هاي كواگولاز مثبت،  DNase مثبت نيز هستند.
اختصاصيت:۲۰% استافيلوكوك هاي كواگولاز منفي، DNase مثبت هستند.
۳-  نمونه اوليه:
پليت هاي LEMB Agar  يا Sheep Blood Trypticase Soy Agar with 5% حاوي
ارگانيسم مورد نظر
۴-  مواد و ابزار مورد نياز: 

• پليت Test Agar DNase
• معرف اسيد كلريدريك ۱N (يك نرمال) يا معرف تولوئيدين بلو ۱/۰%

توجه : پليت هايwith Toluidine  Blue  Test Agar DNase را مي توان مستقيماً بدون افزودن معرف بررسي نمود، چون خود محيط كشت حاوي  g/lit 05/0 از ماده Toluidine Blue O     مي باشد. مقدار اين ماده در محيط كشت نبايد از ۰۰۵/۰ %  تجاوز كند چون در غلظت هاي بالاتر ممكن است  شناسايي فعاليت DNase  را مشكل سازد.
۵-  روش انجام كار:
پليت هاي  DNase Test Agar ياDNase Agar with Toluidine Blue  را با نمونه مورد نظر به صورت نقطه اي (يا خطي) تلقيح نماييد. پليت ها را به مدت ۲۴-۱۸ ساعت در دماي^°۲ ± ۳۵ سانتي گراد انكوبه نماييد. پس از انكوباسيون، روي پليت هاي DNase Test Agar  ساده، اسيد كلريدريك ۱ نرمال و يا تولوئيدين بلو ۱/۰% بريزيد به گونه اي كه سطح پليت را كاملاً بپوشاند و سپس آن را بر روي زمينه تيره قرار داده و بررسي نماييد. تلقيح بايد نقطه اي باشد، چون بعضي از سويه هاي استافيلوكوك اورئوس به خوبي بر روي محيط، رشد نمي كنند و در نتیجه ميزان رشد براي ارزيابي فعاليت DNase كافي نخواهد بود. در صورت تلقیح نقطه ای، حتي اگر در محل تلقيح، رشدي ايجاد نشود مي توان فعاليت DNase را ارزيابي نمود.
 
–   DNase Test Agar که اسيد كلريدريك يک  نرمال روی آن ريخته شده است .

1. a) مثبت : فوراً هاله هاي شفاف كاملاً مشخصي اطراف كلني يا محل تلقيح را در محيط كشت احاطه مي كنند.
2. b) منفي : اطراف كلني ها يا محل تلقيح شفاف نمي شود.

 
– DNase Test Agar که تولوئيدين بلو ۱/۰% روی آن ريخته شده است :

1. a) مثبت: هاله هاي شفاف قرمز صورتي ،اطراف كلني يا محل تلقيح را احاطه مي كنند. محيط در جايي كه DNA باقي مانده باشد آبي مي شود.
2. b) منفي: هاله هاي كدر قرمز صورتي اطراف كلني يا محل تلقيح را احاطه مي كنند.

• پس از انكوباسيون روي پليت هايDNase Test Agar With Toluidine Blue ، معرف ريخته نمي شود و مستقيماً بررسي مي گردد.

1. مثبت (+): هاله شفاف قرمز صورتي واضحي اطراف كلني يا محل تلقيح را در يك محيط آبي (نيلي) احاطه مي كند.
2. منفي (-): بدون تغيير، محيط به رنگ آبي تيره شفاف باقي مي ماند.

 
۶-   برنامه كنترل كيفي (QC):
 
:DNase Test Agar
Staphylococcus aureus ATCC 25923 : رشد متوسط تا زياد، احاطه شده با هاله شفاف
صورتي تا قرمز (كنترل مثبت)
Staphylococcus Epidermidis ATCC 12228: رشد متوسط تا زياد، بدون هاله (كنترل منفي)
DNase Test Agar with Toluidine Blue :
Klebsiella Pneumoniae ATCC  ۳۳۴۹۵ : رشد متوسط تا زياد، بدون هاله (كنترل منفي)
Serratia  marcescens ATCC 13880: رشد متوسط تا زياد، احاطه شده با هاله صورتي شفاف (كنترل مثبت)
۷-  تداخلات: 
بعضي از سويه هاي استافيلوكوك ممكن است روي DNase Test Medium with Toluidine Blue مهار شوند.
پروتئوس ولگاريس، سودوموناس آئروژينوزا و آئروموناس، واكنش هاي مثبت زيادي براي توليد DNase نشان مي دهند.