رنگ آمیزی در میکروب شناسی :
یکی از مشخصات مهم باکتری ها که به شناسایی آنها کمک می کند. رنگ پذیری آنها با رنگ های مختلفی است که برای این منظور به کار می روند.اولين گام در شناسايي باكتريها بررسي مستقيم آنها در زير ميكروسكوپ است.برای این منظور می توان از روشهای زیر استفاده کرد
- بررسی و مشاهده سلولهای زنده و بدون رنگ آمیزی
- بررسی و مشاهده سلولهای مرده و رنگ آمیزی شده با مواد رنگی
باکتریهای زنده تقریبا” بی رنگ بوده و تضاد کافی با محیط خود ندارند لذا بدون رنگ آمیزی بخوبی در زیر ميكروسكوپ ديده نمي‌شوند ولی از نظر شیمیایی کاملا”با محیط اطراف خود متفاوتند. این اختلاف شیمیایی اساس رنگ آمیزی آنها می گردد، زیرا ماده رنگی با مواد شیمیایی موجود در باکتریها واکنش نشان داده و موجب رنگ آمیزی آنها می شود. رنگ آمیزی علاوه بر افزايش كنتراست بين باكتري و محيط، ممكن است به افتراق و شناسايي باكتريها نيز كمك نمايد رنگ های مختلفی که برای این منظور به کار می روند.این رنگ ها در حالت کلی یا رنگ های عمومی هستند یعنی همه باکتری ها را یکسان رنگ می کنند مثل متیلن بلو و یا بصورت رنگ های اختصاصی و افتراقی هستند که فقط گروه خاصی از باکتری ها را رنگ آمیزی می نمایند.
با وجود پیشرفتهاي تکنیکی فراوان در زمینه باکتریولوژي، مطالعه گسترش رنگ آمیزي شده هنوز به عنوان بهترین روش تشخیص فوري عفونت هاي باکتریال مطرح است . در این روش ، بررسی ترشحات، مواد آسپیره شده، مایعات بدنی نظیر مایع مغزي نخاعی (C.S.F) و ادرار از اهمیت خاصی برخوردار است. در این روش علاوه بر مشاهده شکل ، شناسایی و پی بردن به اندازه باکتریها و بررسی سلولهاي موجود در نمونه، تشخیص فرآیند التهابی نیز امکان پذیر است.
اهداف رنگ آمیزي
- نشان دادن میکروارگانیسمها و سلولهاي موجود در نمونه.
- مشاهده شکل ، اندازه وترتیب قرار گرفتن میکروارگانیسم های مورد مطالعه
- مشاهده اجزایی مانند فلاژل، اسپور، کپسول، دانه هاي متاکروماتیک و …
- تفکیک میکروارگانیسمها براساس خواصی چون ساختمان شیمیایی دیواره سلول . مثال رنگ آمیزي گرم
اصول رنگ‌آميزي:
برای اینکه یک ماده بتواند باکتریها و بافتها را رنگ آمیزی کند باید علاوه بر ریشه رنگی که کروموژن نامیده می شود ریشه دیگری نیز داشته باشد که پس از حل شدن در آب یونیزه شده و ماده رنگی را دارای بار الکتریکی مثبت و منفی نماید تا بتواند با مواد اسیدی یا بازی سلولها ترکیب شود که آن را ریشه اگزوکروم می نامند. رنگهائي که پس از یونیزه شدن دارای بار الکتریکی منفی باشند بنام رنگ هائی اسيدي (آنيونيك) معروف هستند رنگ‌هاي اسيدي مانند ائوزين، فوشين اسيدي، روزبنگال بدليل دارا بودن بار منفي به اجزايي از سلول كه داراي بار مثبت هستند اتصال پيدا ميكنند.
رنگهائي پس از یونیزه شدن دارای بار الکتریکی مثبت باشند بنام رنگ هائی قليايي (كاتيونيك) نامیده می شوند مانند متيلن بلو، فوشين بازي، كريستال ويوله، سافرانين و مالاشيت گرين بدليل دارا بودن بار مثبت به اجزايي از سلول كه داراي بار منفي هستند متصل مي‌شوند. رنگ آميزي بر اساس پيوند‌هاي يوني بين بار‌هاي مخالف صورت مي‌گيرد. ميكروب‌ها بدليل دارا بودن شارژ الكتريكي منفي با رنگ‌هاي قلیایی و بازي (كاتيونيك) بهتر رنگ مي‌شوند.
سطح باكتريها داراي خصوصيات اسيدي است زيرا تعداد زيادي گروه‌هاي كربوكسيل (-COOH) در سطح سلول قرار دارد گروه‌هاي كربوكسيل بنيان‌هاي اسيدي در اسيد‌هاي آمينه هستند تعداد زيادي اسيد آمينه در ديواره سلول وجود دارد با يونيزاسيون اين گروه‌هاسطح سلول داراي بار منفي مي‌شود.
-COOH -COO– + H+
ژنوم در باكتريها در داخل سيتوپلاسم پراكنده است اسيد‌هاي نوكلوئيك بدليل وجود يون‌هاي فسفات داراي بار منفي هستند و براحتي با رنگ‌هاي كاتيونيك پيوند برقرار ميكنند.
انواع رنگ آمیزی در میکروب شناسی:
روشهاي مختلفي براي رنگ‌آميزي باكتريها وجود دارد. در يك روش آنها را به انواع ساده و مركب تقسيم‌بندي ميكنند.
در رنگ‌آميزي ساده تنها از يك رنگ مانند متيلن بلو، كريستال ويوله، سافرانين و فوشين استفاده مي‌شود. در اين رنگ‌آميزي همة سلولها به يك صورت رنگ مي‌گيرند.
در رنگ‌آميزي مركب از دو يا چندين رنگ استفاده مي‌شود. اين نوع رنگ‌آميزي علاوه بر تسهيل امكان مشاهدة اشكال مرفولوژيك باكتريها، گروه‌هاي مختلف باكتريها را نيز از همديگر تفكيك ميكند. رنگ آمیزی مرکب می تواند رنگ آمیزی افتراقی، رنگ آمیزی اختصاصی و یا رنگ آمیزی انتخابی و .. باشد مانند رنگ آميزي گرم كه یک در آمیزی افتراقی بوده و در آن باكتري‌هاي گرم مثبت بصورت بنفش و باكتري‌هاي گرم منفي بصورت قرمز مایل به صورتي رنگ مي‌گيرند. رنگ آمیزی ذيل نلسون نوعی دیگری از رنگ آمیزی مرکب و اختصاصی است که براي رنگ‌آميزي باكتري‌هاي اسيد فست (Acid Fast) مانند مايكوباكتريوم‌ها بکار می رود.
در روش ديگر آنها را به انواع مثبت و منفي تقسيم‌بندي ميكنند
در رنگ‌آميزي مثبت باكتري رنگ مي‌گيرد ولي محيط رنگ نمي‌گيرد لذا باكتريها بصورت اجسام تيره و یا رنگی در يك زمينة روشن مشاهده مي‌شوند. مانند رنگ‌آميزي ساده و گرم
در رنگ‌آميزي منفي برعكس، محيط رنگ مي‌گيرد ولي بدليل عدم توانايي نفوذ رنگ در سلول، باكتري رنگ نمي‌گيرد. لذا باكتري بصورت يك جسم روشن در يك زمينة تاريك ديده مي‌شود. مانند رنگ‌آميزي مركب چين براي كپسول پنوموكوك.
مقدمات رنگ آمیزی :
- تهیه گسترش
لامی که برای این منظور بکار می رود باید خشک ، تمیز و عاری از چربی و ترجیحا” لام نو و تازه باشد. قبل از تهیه گسترش بایستی مشخصات بیمار یا نمونه بروی لام با مداد الماس یا ماژیک و یا برچسب خاص ثبت گردد. در صورتيكه از ماژيك براي علامت گذاري لام استفاده می شودبایستی علامت روي لام را توسط يك چسب نواري پوشانده شود تا در وراحل شستشو پاک نشود.
برای تهیه گسترش از محیط کشت مایع با استفاده از حلقه فیلدوپلاتنین یا پیپت پاستورو یا سواب، مقدار کمی از مایع حاوی نمونه مورد آزمایش را برداشته در وسط لام قرار دهید سپس آن را همچون ورقه نازکی روی لام گسترش دهید.هنگامی که از محیط کشت جامد گسترش تهیه می نمایید. ابتدا باید یک قطره سرم فیزیولوژی را روی لام ریخته سپس با فیلدوپلاتین مقداری از کلنی باکتری را برداشته و در قطره سرم فیزیولوژی روی لام حل کنید تا شیرابه یکنواختی تهیه شود بعد آن را در وسط لام پخش نمایید. علت اینکه از آب مقطر برای تهیه لام استفاده نمی کنیم این است که آب مقطر فشار اسمزی را تغییر داده و باعث لیز باکتری ها می شود.
برای تهیه گسترش باید مقدار مناسبی از باکتری را روی لام قرار داد چرا که اگر گسترش خیلی ضخیم باشد به معنی آن است که مقداری زیادی از باکتری روی لام قرار گرفته که می تواند مانع عبور نور شود. همچنین در گسترش ضخیم باکتری ها اغلب روی همدیگر قرار دارند و مشاهده تک تک آنها مشل می شود. گسترش ضخیم معمولا” توسط افراد مبندی و از کشت های جامد تهیه می گردد.
نقطه مقابل این مشکل تهیه گسترش خیلی نازک است یعنی تعداد بسیار کمی باکتری روی لام قرار می گیرد ودر نتیجه پیدا کردن آنها با میکروسکپ مشکل است. اینگونه گسترش ها بیشترازمحیط کشت های مایع تهیه می گردند.
- لام تهیه شده نباید وسیع باشد به عبارت دیگر اسمیر تهیه شده بهتر است در وسط لام و به میزان مناسب تهیه شود.
- نکته بسیار مهمی که باید در تهیه لام به آن دقت کرد این است که همیشه باید از یک کلنی مشخص بر روی محیط کشت نمونه برداری کرد تا در بررسی میکروسکوپیک دچار سردرگمی نشویم.
- خشک کردن :(Drying)
پس از تهیه گسترش لام را روی سطحی صاف و هموارقرار داده و صبر کنید تا در دماي معمولی آزمایشگاه خشک گردد . براي خشک کردن نباید از روشهاي دیگر استفاده کرد.
- ثابت کردن(Fixation) :
چون ممکن است براثر رنگ آمیزي و شستشوي مکرردر مراحل مختلف رنگ آمیزی، باکتریها از روي لام کنده شوند، لازم است گسترش را ثابت نماییم تا بطریقی باکتریها مرده و به سطح لام بچسبند. اسميرها ی تهیه شده ممكن است با حرارت يا متانول فيكس شوند.
الف- تثبیت گسترش با استفاده از حرارت یا روش فیزیکی:
در روش فيزيكي که روش متداول و مرسوم می باشداز حرارت استفاده مي‌شود اين روش يكي از ساده ترين روش‌هاست در اين روش لام حاوي گسترش را ۳-۴ بار از روي شعلة چراغ بنسون عبور مي‌دهند.
اين مرحله از حساسيت زيادي برخوردار است برای اینکه استفاده از حرارت زياد باعث تخريب ساختار و از بين رفتن باكتريها و سلولها شده و در صورت عدم حرارت كافي فيكساسيون و تثبت بدرستي انجام نشده و در طي مراحل رنگ‌آميزي گسترش روی لام شسته شده و از بين خواهد رفت. براي در نظر گرفتن حرارت مناسب که حدود۷۰ درجه سانتیگراد است بهتر است با پشت دست امتحان کنیم بدین ترتیب که قسمت پشت لام را چندين مرتبه به آهستگی از روي شعله چراغ عبور داد بحدي كه در صورت تماس با پشت دست آنرا نسوزاند. سپس بگذاريد لام قبل از رنگ آميزي کاملا”خنك شود.
ب- روش شيميايي : در روش شيميايي که بهترین روش تثبیت لام می باشد از الكل متانول استفاده مي‌شود از آنجا كه حفظ مشخصات سلولهاي ميزبان جهت تفسير گستره هاي باليني ضروري است بهترين روش براي رنگ آميزي گستره هاي مستقيم، فيكس كردن با استفاده از متانول است. اين امر با ممانعت از ليز گلبول های قرمز و تخريب سلول هاي ميزبان موجب واضح تر شدن زمينه اسلايد می گردد كه تفسير نمونه راآسانتر ميكند. اين روش براي همه نمونه های باليني، مخصوصاً ادرار موکدا” توصيه مي شود كه در عين حال مانع از شسته شدن نمونه هاي ادرار مي گردد.
براي یک دقيقه چند قطره متانول روي لام بريزيد. متانول را بدون آبكشي از روي لام خالي كنيد و اجازه دهيد تا بقایاي الکل تبخیرگردد و اسلايد در مجاورت هوا خشك شود.
بطور کلی ثابت کردن باعث انعقاد پروتئینهاي باکتري و سلولها می گردد و به لام می چسبند و شسته نمی شوند.
