بیوتکنولوژیژنتیکسلولی مولکولیمطالب علمی

روش انجام کلونینگ با جزئیات کامل+ فیلم

 

فهرست مطالب

همسانه سازی ژن.. ۱

۱-۱- تاریخچه همسانه‌سازی ژن.. ۱

۱-۲- ابزارهای کار مهندسی ژنتیک… ۲

۱-۳- آنزیم‌های مورد استفاده ۳

۱-۴- تکنیک‌های مورد استفاده در همسانه‌سازی.. ۹

۱-۵- ناقلین همسانه‌سازی.. ۹

۱-۶- میزبان‌ها ۱۴

۱-۷- تراریختی Transformation.. 16

۱-۸- غربالگری α-complementation.. 16

۱-۹- استخراج پلاسمید و تعیین تعداد نسخه های آن.. ۲۱

پروتکل آزمایشگاهی.. ۲۳

۲-۱- تهیه محیط کشت باکتری.. ۲۳

۲-۲- کشت خطی و کشت مایع باکتری DH5α.. ۲۴

۲-۳- تهیه سلول‌های مستعد. ۲۵

۲-۴- واکنش پیوند (لیگاسیون) ۲۶

۲-۵- انتقال پلاسمیدها به باکتری (ترانسفورماسیون) ۲۷

۲-۶- غربالگری پرگنه‌‌ها ۳۰

۲-۷- استخراج پلاسمید نوترکیب… ۳۰

۲-۷-۱- استخراج پلاسمید از روش دستی.. ۳۰

۲-۷-۲- استخراج پلاسمید با استفاده از کیت Roche. 33

۲-۸- تعیین کیفیت و کمیت پلاسمید نوترکیب استخراج شده ۳۳

پیوست ۱٫٫ ۳۵

 

 

فهرست شکل ها

شکل ۱-۱- شمای کلی انجام همسانه‌سازی.. ۱

شکل ۱-۲- شمای لیگاسیون در TA Cloning. 6

شکل ۱-۳- تولید کنکاتمر از محصولات PCR دارای انتهای صاف.. ۸

شکل ۱-۴- الف)باکتریوفاژ لامبدا ب) باکتریوفاژ M13.. 10

شکل ۱-۵- نقشه پلاسمید pTZ57R/T و مکان‌های برشی آن. ۱۳

شکل ۱-۶- اپران لاکتوز ۱۷

شکل ۱-۷- ساختار تترامر آنزیم بتاگالاکتوزیداز ۱۸

شکل ۱-۸- تنظیم اپران لاکتوز ۱۹

شکل ۱-۹- استراتژی α-complementation مورد استفاده در همسانه سازی ژن ها ۲۰

 

 

 

فهرست جداول

جدول ۱-۱- جدول بازده برش بعضی از اندونوکلئاز های متداول. ۵

جدول ۱-۲: ساختار انتهای ′۳ محصولات تولیده بوسیله Taq پلیمراز ۶

جدول ۱-۳: عناصر ژنتیکی ناقل pTZ57R/T. 14

جدول ۱-۴: خصوصیات ژنتیکی باکتری DH5α.. ۱۵

 

 

همسانه سازی ژن

۱-۱- تاریخچه همسانه‌سازی ژن

سالهای ۱۹۷۱ تا ۱۹۷۳ را به عنوان یک دگرگونی در بیولوژی مدرن نام می‌برند. در این سال‌ها یک متدولوژی کاملاً جدید توسعه یافت و امکان داد تا آزمایشهایی که قبلاً عملی نبودند، با موفقیت طرح‌ریزی و انجام شوند. این روشها تحت عنوان تکنولوژی نوترکیبی DNA یا مهندسی ژنتیک نامیده شده‌اند و فرآیند همسانه‌سازی ژن‌ها را در بر می‌گیرند. هدف از همسانه‌سازی ژن فراهم کردن نسخه‌های متعدد از یک ژن منفرد است. تکثیر یک ژن در حوزه‌های مختلف تحقیقاتی مورد استفاده است.

۱ شکل ۱-۱- شمای کلی انجام همسانه‌سازی

 

۱-۲- ابزارهای کار مهندسی ژنتیک

ابزارهای کار مهندسی ژنتیک در آزمایشگاه عبارتند از :

۱- باکتری بعنوان میزبان.

۲- پلاسمید (یا بقیه ناقلین) به عنوان حامل ژن.

۳- آنزیم بعنوان وسیله برش و اتصال قطعات DNA به یکدیگر.

مراحل اصلی در همسانه‌سازی ژن عبارتند از:

  • تولید یا جداسازی قطعه‌ای از DNA حاوی ژنی که باید همسانه شود. این قطعه را می‌توان از تکنیک PCR در ساخت ژن و یا با استفاده از آنزیم‌های محدودگر تولید نمود. این قطعه را وارد یک ملکول حلقوی DNA که ناقل نامیده می‌شود می‌کنند. تا کنون ناقل‌های بسیاری چه به صورت طبیعی کشف و یا به صورت صنعتی متناسب با روش‌های متفاوت تولید شده‌اند. از معمول‌ترین ناقل‌ها می‌توان به پلاسمیدها، فاژ، کاسمیدها و فاژمید‌ها اشاره کرد. ورود قطعه مورد نظر به داخل پلاسمید تولید یک مولکول نوترکیب DNA می‌کند.
  • ناقل ژن را به سلول میزبان حمل می­نماید که معمولاً یک باکتری است. باکتری‌هایی که به عنوان میزبان در کارهای مهندسی ژنتیک قابل استفاده می‌باشند دارای خصوصیات ویژه‌ای هستند.
  • باکتری‌هایی که ناقل را دریافت می‌کنند توانایی رشد در محیط­های کشت انتخابی را پیدا می‌کنند و شروع به تکثیر می‌کنند. در درون باکتری، ناقل نیز تکثیر می‌یابد و در واقع از ژنی که حمل می‌کند نسخه‌های مشابه و متعددی تولید می­نماید. این ناقلین در هنگام تقسیم میزبان به نتاج منتقل شده و همانندسازی ناقل تا رسیدن به باکتری به فاز مرگ ادامه پیدا می‌کند.
  • پس از تقسیم زیاد سلول میزبان، هر سلول بسته به طبیعت ناقل دارای یک یا تعداد بیشتری از ناقل نوترکیب خواهد بود.

۱-۳- آنزیم‌های مورد استفاده

دستورزی DNA نیاز به بکارگیری تعدادی از آنزیم‌ها دارد. این آنزیم‌ها به صورت طبیعی در داخل سلول وظایف متعددی از جمله همانندسازی، نسخه برداری، ترجمه و دیگر پروسه‌های بیولوژیکی را بر عهده دارند. واکنش‌هایی که بوسیله ‌این آنزیم‌ها کاتالیز می‌شوند یک بخش ضروری از همسانه‌سازی ژن را تشکیل می‌دهند (احمدیان تهرانی، ۱۳۷۷). برخی از مهمترین این آنزیم‌ها عبارتند از:

الف) آنزیم‌های محدودگر: این آنزیم‌ها اندونوکلئاز‌هایی هستند که پیوندهای فسفودی استر داخل اسیدهای نوکلئیک را در یک توالی خاص برش می‌دهند. این توالی به عنوان سایت برشی آنزیم نام برده می‌شود. همچنین این آنزیم‌ها براساس نوع برشی که ‌ایجاد می‌کنند به دو دسته آنزیم‌های تولیدکننده پایانه‌های صاف و پایانه‌های چسبنده تقسیم بندی می‌شوند. عموماً برای کارهای مرتبط با همسانه سازی سعی بر استفاده از آنزیم هایی است که تولید محصولات با انتهای چسبنده می کنند. زیرا در زمان لایگشن به انرژی کمتری نسبت به انتهای صاف برای اتصال نیاز دارند. توالی های برشی این آنزیم ها به صورت پالیندروم است (به عنوان مثال GGGCCC). جهت شناسایی مکان های برشی بر روی یک قطعه DNA می توان از نرم افزار هایی همچون Primer Premier 5.0 استفاده نمود. همچنین سایت های اینترنتی نیز به این منظور طراحی گردیده اند که آدرس آنها در پیوست ۱ آورده شده است. جهت استفاده از این آنزیم ها نیاز است که حتماً جایگاه برشی آنها در ناحیه مطلوب و مورد نظر ما قرار داشته باشد. معمولاً این جایگاه ها را می توان با استفاده از PCR به انتهای محصولات اضافه نمود.

  • نکته: قبل از ورود به یک پروسه همسانه سازی ژن نیاز است که حتماً وکتور مورد استفاده و میزبان مناسب انتخاب شده باشند.
  • نکته: قبل از اضافه کردن جایگاه های برشی آنزیم های محدودالأثر به انتهای پرایمر ها از نوع آنزیم و جایگاه برشی آن در وکتور و خود قطعه DNA اطلاع یابید.
  • نکته: جهت اضافه کردن جایگاه های برشی آنزیم ها به انتهای ‘۵ پرایمر های PCR (به صورت Linker) توجه کنید که حتماً چند نوکلئونید (بین ۳ تا ۱۰) پس از جایگاه برشی آنزیم قرار گرفته باشد تا از برش موثر محل شناسایی پس از ورود پرایمر به داخل محصول PCR اطمینان حاصل شود (جدول ۱-۱).

 

 

 

 

۱ جدول ۱-۱- جدول بازده برش بعضی از اندونوکلئاز های متداول.

جایگاه برش آنزیم به صورت قلم سیاه نشان داده شده است.

 

در این کارگاه جهت همسانه سازی ژن از تکنیک TA Cloning استفاده می شود. اساس این روش بر این اصل استوار است که آنزم Taq DNA Polymerase که در تکثیر DNA در طی مراحل PCR استفاده می شود یک نوکلئوتید آدنین را به صورت اتوماتیک در انتهای ‘۳ محصولات خود اضافه می کند. پس همه محصولات تولید شده توسط این آنزیم دارای یک نوکلئوتید اضافی آدنین در انتهای ‘۳ خواهند بود. از این ویژگی آنزیم استفاده شده است و پلاسمید هایی طراحی شده است که به شکل خطی هستند و در انتهای ‘۳ خود دارای یک باز تیمین هستند که می تواند با باز آدنین پیوند هیدروژنی برقرار کند و لذا لیگاسیون با راندمان بیشتری در این موارد نسبت به محصولات دارای انتهای صاف انجام می شود (شکل ۱-۲)

 

۲ شکل ۱-۲- شمای لیگاسیون در TA Cloning

 

  • نکته: هو، (۱۹۹۳) نشان داد وقتی نوکلئوتید انتهایی ′۵ آغازگرها آدنین، سیتوزین، گوانین یا تیمین باشد، راندمان اضافه کردن آدنین انتهایی به محصولات تحت تأثیر قرار می‌گیرد. جدول ۱-۲ نشان‌دهنده میزان فعالیت آنزیم Taq برای اضافه نمودن نوکلئوتید به انتهای ′۳ محصولات تولیدی آن در شرایط متفاوت آغازگرها می‌باشد.

 

۲ جدول ۱-۲: ساختار انتهای ′۳ محصولات تولیده بوسیله Taq پلیمراز

نوکلئوتید انتهایی ′۵ آغازگر نوکلئوتید انتهای ′۳ در رشته مکمل در محصولات
A T +A , -T
C G +G > +A >> +C
G C +A > +C
T A (+A) در یک راندمان خیلی پایین

منبع: هو، ۱۹۹۳

 

  • نکته: چنانچه تصمیم دارید در آزمایشات خود از TA Cloning استفاده کنید پس در هنگام طراحی پرایمر به نوکلئوتید انتهایی ‘۵ پرایمر ها دقت کنید.
  • نکته: آنزیم Pfu فعالیتی مانند Taq جهت اضافه کردن آدنین انتهایی به محصولات خود ندارد.

 

ب) لیگازها: دو قطعه DNA با پایانه‌های چسبنده‌ای که مکمل هم باشند می‌توانند به یکدیگر متصل شوند. آنزیم T4 باکتریوفاژ در حضور ATP می‌تواند باند فسفودی استر بین ۳′-OH و ۵′-P را برقرار کند. اتصال قطعات با انتهای صاف به علت عدم وجود بازهای انتهایی جفت شونده با راندمان پایین‌تری انجام می‌شود. با استفاده از آنزیم‌های محدودگر و لیگازها می‌توان DNA را از مناطق نامطلوب جدا کرد و مجدداً دو قطعه را به هم متصل کرد.

  • نکته: در برخی موارد که در اضافه کردن linker به انتهای ‘۵ پرایمر ها با محدودیت مواجه هستیم می توانیم محصولات PCR را قبل از هضم آنزیمی بوسیله لیگاز ها به هم متصل کنیم و پس از آن از آنزیم های برشی استفاده کنیم. در این صورت با عنایت به این نکته که جایگاه برشی آنزیم ها پالیندروم است می توان فقط نیمی از جایگاه برشی آنزیم ها را به انتهای ‘۵ پرایمر اضافه کنیم (شکل ۱-۳).

 

۳ شکل ۱-۳- تولید کنکاتمر[۱] از محصولات PCR دارای انتهای صاف

 

ج) آنزیم‌های DNA پلیمراز: استفاده از این آنزیم‌ها در اغلب کارهای مهندسی ژنتیک وجود دارد. از جمله ‌این آنزیم‌ها می‌توان Taq I و Pfu را نام برد. با توجه به استراتژی انتخاب شده جهت همسانه‌سازی ژن کاربرد هر یک از آنزیم‌ها جایگاه خود را دارد. از Taq I به علت اینکه در انتهای ′۳ محصولات خود یک نوکلئوتید آدنین اضافه می‌کند در همسانه­سازی TA و از Pfu به علت دقت بالای آن در برنامه‌هایی که قصد تولید پروتئین از DNA نوترکیب را دارند استفاده می‌کنند و از دیگر آنزیم‌های متعلق به‌این گروه می‌توان Pol I (DNA پلیمراز I در E. coli)، DNA پلیمراز T4 و T7 از باکتریوفاژ و نسخه‌بردار معکوس[۲] را نام برد.

  • نکته: خصوصیت Proof Reading در آنزیم های DNA پلیمراز به معنای دقت بالاتر این دسته از آنزیم ها در تولید محصولات خود می باشد. آنزیم Pfu از جمله این آنزیم ها می باشد. در آزمایشاتی که هدف از همسانه سازی ژن در نهایت تولید پروتئین است استفاده از این آنزیم مناسب تر است.

د) فسفاتاز‌ها و کینازها : پیوند دو قطعه DNA با یکدیگر نیازمند پایانه‌های ۳′-OH و ۵′-P در دو مولکول می‌باشد. اضافه (فسفریلاسیون) یا حذف (دفسفریلاسیون) کردن فسفات باعث تنظیم عمل لیگاز می‌شود.

۱-۴- تکنیک‌های مورد استفاده در همسانه‌سازی

حجم بسیار زیادی از پروتکل‌های مختلف برای استفاده در یک پروسه همسانه‌سازی وجود دارد که فهم اساس کار آنها سخت نیست. استخراج و جداسازی DNA، الکتروفورز ژل آگارز، پلی‌اکریل‌آماید، وسترن بلات، ساترن بلات، کلونی بلات، دورگه‌گیری، توالی‌یابی DNA و PCR را می‌توان از جمله ‌این تکنیک‌ها نام برد.

۱-۵- ناقلین همسانه‌سازی

برای انتقال یک DNA خارجی به داخل یک سلول میزبان در اکثر موارد نیاز به استفاده از یک ناقل وجود دارد. ناقل‌ها ملکول‌های DNA هستند که ژن را به سلول میزبان (میکروب، گیاه، جانور) انتقال می‌دهند و عناصر کلیدی برای کنترل نسخه برداری و بیان ژن را دارا می‌باشند. انتخاب ناقل مورد نظر بر اساس نوع سلول میزبان و هدف آزمایش صورت می‌گیرد. ناقلین مورد استفاده برای سلول‌های باکتریایی شامل پلاسمید‌ها، باکتریوفاژ λ ، M13 و فاژمیدها می‌باشند.

– باکتریوفاژ ها: ویروس های آلوده کننده باکتری ها هستند که وقتی وارد فاز لایتیک می شوند، نسخه های بسیار زیادی از ژنهای خود و ژن های نوترکیب تولید می کنند. این فاژ ها نسبت به پلاسمید ها دارای مزیت هایی هستند از جمله نفوذ بسیار موثر و اختصاصی به داخل سلول های میزبان و بیان مناسب ژن های کلون شده به سبب داشتن پروموتورهای خاص. از مهمترین بکتریوفاژ ها می توان به باکتریوفاژ لامبدا و M13 اشاره کرد (شکل ۱-۴).

 

 

الف                                              ب

۴ شکل ۱-۴- الف)باکتریوفاژ لامبدا ب) باکتریوفاژ M13

 

– کازمید ها: درلغت به معنای حاصل از COS و در حقیقت قطعات حاصل از دو انتهای ژنوم خطی باکتریوفاژ لامبدا (Cohesive Ends) می باشند. این قطعات مکمل هم بوده و می توانند به هم بچسبند. این دو قسمت از ژنوم ویروس جدا شده و به دو سر یک قطعه DNA نوترکیب متصل می شوند. قطعات حاصل می توانند به راحتی در داخل کپسول باکتریوفاژ جا بگیرند و در نتیجه وارد سلول باکتری شوند و در داخل سلول به صورت حلقوی درآمده و مانند یک پلاسمید عمل کنند.

– فاسمید ها: ترکیبی از ژنوم باکتریوفاژها . پلاسمید هاست.

– پلاسمید‌ها معمولاً کمتر از ۵۰۰۰ جفت نوکلئوتید طول دارند. مولکول‌های بزرگ به علت اینکه سریع تخریب می­شوند کار با آنها مشکل است. از طرفی کارایی انتقال نیز با افزایش اندازه پلاسمید رابطه معکوس دارد. پلاسمید‌هایی که در همسانه‌سازی استفاده می­شوند دارای چندین عنصر ساختاری هستند:

الف) منطقه شروع همانند‌سازی (Ori): همانند‌سازی DNA ناقل با استفاده از سیستم آنزیمی میزبان می باشد. چنانچه ori دو پلاسمید از یک منشا باشند هنگام ترانسفورماسیون با هم رقابت کرده و فقط یکی از آنها وارد باکتری می شود اما اگر منشا ori آنها با هم اختلاف داشته باشد هنگام ترانسفورماسیون دو پلاسمید نیز می توانند وارد یک سلول شوند که این مسئله در روندهای همسانه سازی اهمیت خاصی دارد.

ب) مکان‌های همسانه‌سازی: ناقلین پلاسمیدی به طور مصنوعی دارای سایت برشی برای تعداد زیادی از آنزیم‌های محدودگر دارند. به‌این مکان‌های برشی MCS[3] می‌گویند که برای اضافه کردن DNA خارجی از آنها استفاده می‌شود.

ج) نشانگرهای قابل انتخاب: این نشانگرها معمولاً ژن‌های مقاومت به آنتی­بیوتیک‌ها (به عنوان مثال تتراسایکلین و یا آمپی­سیلین) هستند. هدف از مد نظر قرار دادن این نشانگرها غربالگری سلول‌های دریافت کننده پلاسمید می‌باشد.

د) برخی از پلاسمید‌ها همچنین دارای یک ناحیه پروموتور در بالادست MCS هستند. این ساختار توانایی نسخه برداری و ترجمه از DNA اضافه شده را ایجاد می‌کند. البته باید از صحت توالی اضافه شده اطمینان داشت.

ه) پلاسمید ها را می توان بر اساس تعداد کپی که می توانند در داخل سلول ایجاد کنند طبقه بندی نمود. بعضی از پلاسمیدها تعداد زیادی کپی در داخل سلول باکتری دارند که پلاسمیدهای با تعداد نسخه بالا نامیده می شوند(همانند سازی این پلاسمیدها به کروموزوم باکتری بستگی ندارد). به این دسته از پلاسمیدها Relaxed Plasmid هم گفته می شود. تعداد دیگری از پلاسمیدها تعداد کپی محدودتری در داخل سلول باکتری ایجاد می کنند که به پلاسمیدهای با تعداد نسخه کم معروف هستند و باکتری شدیداً تکثیر آنها را کنترل می کند که این دسته به Stringent Plasmid هم معروف می باشند.

  • نکته: جهت افزایش تعداد کپی های پلاسمید در داخل باکتری می توان پس از رشد باکتری به میزان کافی کلارمفنیکل به محیط اضافه نمود در این صورت باکتری تقسیم نمی شود و پلاسمید می تواند تا تعداد بیشتری از خود در داخل باکتری تولید کند.

ناقل مورد استفاده در این کارگاه pTZ57R/T می باشد که دارای مشخصات زیر است:

این پلاسمید به شکل خطی است و در دو انتهای ′۳ خود حاوی ddT است که این خصوصیت آن با توجه به‌اینکه آنزیم Taq پلیمراز هم به انتهای ′۳ محصولات تولیدی خود ddA را اضافه می‌کند موجب شده است که جهت همسانه‌سازی TA مناسب گردد. شکل ۳-۳ ساختمان پلاسمید pTZ57R/T را به همراه مکان‌های برش برای اندونوکلئازهایی که قادر به برش آن هستند نشان می‌دهد. قسمت‌های ژنتیکی این پلاسمید در جدول ۱-۱ توضیح داده شده‌اند.

 

۵ شکل ۱-۵- نقشه پلاسمید pTZ57R/T و مکان‌های برشی آن.

 

۱-۶- میزبان‌ها

میزبان‌های مورد استفاده در مهندسی ژنتیک می‌توانند باکتری، گیاه یا جانوران باشند. باکتری‌هایی که به عنوان میزبان در کارهای مهندسی ژنتیک استفاده می‌شوند می‌بایست دارای خصوصیات ویژه‌ای باشند. باکتری مورد استفاده در این کارگاه باکتری E. coli سویه DH5α بود که برخی از خصوصیات ژنتیکی آن عبارتند از:

DH5α: F endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ۸۰dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK+), λ–

 

۳ جدول ۱-۳: عناصر ژنتیکی ناقل pTZ57R/T.

قسمت عملکرد موقعیت
rep (pMB1) منشأ همانند سازی پلاسمید ۱۷۳۶-۱۱۲۲
bla (ApR) ژن بتالاکتاماز ، ایجاد مقاومت به آمپی­سیلین ۲۷۵۶-۱۸۹۶
f1 (IG) توالی‌های مورد نیاز برای شروع و خاتمه همانند سازی DNA فاژ ۴۵۷-۲
LacZ ناحیه‌ای از اپرون lac باکتری E. coli ۷۳-۴۴۹
MCS نقشه یابی، غربالگری و برش قطعه ۶۹۵-۶۱۵
T7 Promotor نسخه برداری in vitro از قطعه بوسیله RNA پلیمراز T7 ۷۱۶-۶۹۷

 

 

۴  جدول ۱-۴: خصوصیات ژنتیکی باکتری DH5α

خصوصیت ژنتیکی عملکرد
F (Fertility) فاقد اپی­زومی که پیلی جنسی تولید می‌کند که برای آلوده کردن باکتری به فاژ M13 نیاز است.
endA1 موتاسیونی که باعث غیرفعال کردن یک آنزیم اندونوکلئاز داخل سلولی می‌شود. این آنزیم DNA پلاسمیدی را تخریب می‌کند.
glnV44 نام سیستماتیک Sup E44 می‌باشد. این موتاسیون باعث تخریب کدون پایان و اضافه شدن گلوتامین می‌شود. این خصوصیت برای رشد برخی از فاژها ضروری است.
thi-1 نیازمند تیامین.
recA1 برای کاهش وقوع نوترکیبی‌های ناخواسته در DNA همسانه‌شده نیاز است. سلول‌های با این خصوصیت به UV حساسند و در ترمیم DNA نقص دارند.
relA1 دارای فنوتیپ relax هستند، اجازه می‌دهند تا بدون تولید پروتئین RNA بتواند سنتز شود.
gyrA96 موتاسیونی در DNA gyrase، باعث ایجاد مقاومت به اسید نالیدیکسیک می‌شود.
deoR ژن تنظیم کننده ژن‌های سنتزکننده دیوکسی هگزوز‌ها. این ژن اجازه جذب پلاسمیدهای بزرگ را صادر می‌کند.
nupG همانند deo R عمل می‌کند.
Φ۸۰ حامل فاژ Φ۸۰٫
lacZΔM15 یک حذف جزیی در ژن lacZ (اسید‌های آمینه ۱۱ تا ۴۴) که باعث تکمیل شدن α از ژن β-گالاکتوزیداز می‌شود. این خصیصه برای غربالگری آبی و سفید در محیط‌های کشت حاوی XGal ضروری است.

منبع: http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes#DH5.CE.B1

۱-۷- تراریختی Transformation

پس از انتخاب سیستم حامل میزبان مناسب، حال می خواهیم ببینیم چگونه می توانیم DNA نوترکیب حاصل را وارد میزبان کنیم.

  • ویروس ها و باکتریوفاژها
  • الکتروپوریشن[۴]
  • تفنگ ذره ای[۵]
  • اتصال پروتوپلاسمی
  • ریز تزریق[۶]
  • ترانسفورماسیون با استفاده از شوک حرارتی (در قسمت روش ها عملی توضیح داده شده است)

۱-۸- غربالگری α-complementation

سه خصوصیت اصلی در همه ناقلین مشترک است: ۱- قدرت تکثیر در میزبان ۲- محل ورود ژن خارجی ۳- یک شاخص انتخابی.

از جمله شاخص های انتخابی موجود بر روی حامل ها می توان به مقاومت به آنتی بیوتیک ها، توانایی مصرف مواد و نیاز های متابولیسمی اشاره کرد. در این کارگاه سوش باکتری انتخاب شده یک باکتری لاکتوز منفی است و ناقل انتخاب شده علاوه بر ایجاد مقاومت نسبت به آمپی سیلین امکان غربالگری آبی-سفید را نیز فراهم می کند. اساس این غربالگری در زیر توضیح داده شده است:

– آشنایی با اپران lac در باکتری E.coli : در موجودات پروکاریوتی اینترون ها وجود ندارند. توالی های کد کننده آنزیم هایی که مسئولیت کاتالیز یک مسیر بیوشیمیایی خاص را بر عهده دارند معمولاً در یک اپران سازماندهی شده اند و کل اپران توسط یک ناظم روشن یا خاموش می شود. یک مثال بارز از این سیستم اپران لاکتوز می باشد که سه منطقه کد کننده lac Z، lac Y و lac A به صورت پلی سیسترونیک در کنار هم قرار گرفته اند (شکل ۱-۶).

 

۶ شکل ۱-۶- اپران لاکتوز

 

بتاگالاکتوزیداز و ترانس استیلاز مسئولیت شکستن لاکتوز به گلوکز و گالاکتوز را بر عهده دارند و پرمئاز مسئول وارد کردن لاکتوز به داخل سلول است. در حالت عادی این اپران خاموش است اما هر گاه لاکتوز در محیط اضافه شود اپران روشن شده و آنزیم های لازم برای استفاده از لاکتوز را بیان می کند. این سیستم جهت غربالگری استفاده شده است. به موارد زیر دقت کنید:

۱- آنزم بتاگالاکتوزیدار یک آنزیم تترامر می باشد (شکل ۱-۷). سوش باکتری E.coli DH5α داراری خصوصیت ژنتیکی lacZΔM15 می باشد (ر.ک. به جدول ۱-۴). لذا در این باکتری زیرواحد آلفا جهت تکمیل شدن آنزیم بتاگالاکتوزیداز تولید نمی شود و حتی با روشن بودن اپران لاکتوز در این باکتری ها ارگانیسم قادر به تجزیه لاکتوز نخواهد بود.

 

۷ شکل ۱-۷- ساختار تترامر آنزیم بتاگالاکتوزیداز

 

۲- طریقه تنظیم شدن اپران لاکتوز:  پروتئین رپرسور توسط ناحیه lacI کد شده و به صورت تترامر به ناحیه اپراتور (O)  می چسبد و از رو نویسی اپران جلوگیری می کند. در زمانی که لاکتوز در محیط وجود داشته باشد لاکتوز می تواند با پروتئین رپرسور باند شود و درنتیجه آن اپران می تواند بیان شده و لاکتوز را کاتابولیسم کند. پس از کاهش یافتن لاکتوز دوباره رپرسور می تواند به اپراتور باند شود و از بیان اپران جلوگیری کند.

۳-  X-Gal و IPTG: آنالوگ های لاکتوز نیز می توانند با پروتئین رپرسور باند شوند و باعث روشن شدن اپران لاکتوز گردند. از جمله این آنالوگ ها IPTG است (شکل ۱-۸). آنزیم بتاگالاکتوزیداز نیز علاوه بر لاکتوز می تواند ماده ای به نام X-Gal را نیز بشکند که در اثر این فعالیت رنگ آبی در کلنی های باکتریایی ایجاد می شود.

 

۸ شکل ۱-۸- تنظیم اپران لاکتوز

 

۴- pTZ57R/T: این پلاسمید دارای یک منطقه lacZ می باشد که در واقع زیرواحد آلفا برای آنزیم بتاگالاکتوزیداز می باشد. همچنین قسمت MCS این پلاسمید نیز در همین ناحیه قرار داده شده است (ر.ک. شکل ۱-۵).

حال مطالب را ذکر شده در بالا را با هم در نظر بگیرید. در پروسه ترانسفورماسیون سه حالت از باکتری ممکن است وجود داشته باشد.

۹ شکل ۱-۹- استراتژی α-complementation مورد استفاده در همسانه سازی ژن ها

 

۱- باکتری هایی که پلاسمید به آنها منتقل نشده است: این باکتری ها به علت اینکه به آمپی سیلین مقاوم نیستند در محیط کشت حاوی آمپی سیلین رشد نمی کنند.

۲- باکتری هایی که پلاسمید self ligate به آنها منتقل شده است: این باکتری ها به آمپی سیلین مقاومند و زیرواحد آلفا نیز توسط قسمت lacZ پلاسمید بیان می شود. لذا در محیط کشت انتخابی رشد می کنند و چون IPTG و X-Gal نیز در محیط پخش شده اند اپران لاکتوز روشن شده با شکسته شدن X-Gal کلنی این باکتری ها رنگ آبی به خود می گیرد.

۳- باکتری هایی که پلاسمید نوترکیب را دریافت کرده اند: در محیط کشت انتخابی رشد می کنند اما چون قسمت lacZ پلاسمید با وارد شدن قطعه DNA خارجی تخریب شده است کلنی نمی تواند X-Gal را بشکند لذا کلنی به رنگ سفید مشاهده خواهد شد (شکل ۱-۹).

  • نکته: دو پلاسمید متفاوت که هر دو یک نوع منطقه Ori دارند نمی توانند در یک باکتری حضور داشته باشند.

۱-۹- استخراج پلاسمید و تعیین تعداد نسخه های آن

پلاسمید نیز مانند ژنوم از اسید های نوکلئیک ساخته شده است. استخراج اسید های نوکلئیک را می توان بوسیله پروتکل های زیادی انجام داد اما اساس کار اکثر آنها مبنی بر حذف بقایای سلولی، چربی ها و پروتئین ها از عصاره سلولی و نهایتاً تخلیص اسید نوکلئیک می باشد. اما در استخراج پلاسمید نیاز است علاوه بر حذف چربی، پروتئین و بقایای سلولی،  DNA ژنومی باکتری ها نیز حذف شود و این در حالی است که به لحاظ ماهیت شبیه پلاسمید است. یک پروتکل مورد قبول در این زمینه استفاده از دترجنت ها، اسیدها و بازها برای ایجاد یک محدوده pH می باشد. ابتدا سلول لیز شده و عصاره سلولی تهیه می شود و پس از آن شوینده ها برای رسوب پروتئین و چربی استفاده می شوند. جهت حذف DNA ژنومی از تغییر ناگهانی pH استفاده می شود. به این صورت که ابتدا محیط را تا محدوده ای که در آن DNA دناتوره شود قلیایی می کنند. پلاسمید به علت شکل حلقوی و ابر مارپیچ آن ماندگاری بیشتری را نشان می دهد. در این شرایط کاهش سریع pH محیط منجر می شود تا DNA ژنومی تمایل به بدست اوردن کانفورماسیون طبیعی خود داشته باشد اما با توجه به وجود تعداد زیادی ژنوم یکسان از یک کلنی DNA ها با هم ترکیب شده و تشکیل یک مولکول بزرگ با وزن مولکولی زیاد را می دهند در حالی که پلاسمید اندازه بسیار کوچکتری نسبت به این مولکول های در هم پیچیده دارند. از این تفاوت در اندازه استفاده می شود و طی سانتریفیوژ پلاسمید از بقیه مواد سلولی جدا می شود. حذف RNA نیز می تواند در طی این مراحل یا در انتها بوسیله RNase انجام شود.

پلاسمید استخراج شده بوسیله نانودراپ اسپکتروفتومتری تعیین غلظت می شود. حال با توجه به این که توالی پلاسمید نوترکیب را داریم وزن مولکولی آن را می توان محاسبه نمود. به این منظور می توان از وب سایت های اینترنتی که به همین منظور طراحی شده اند استفاده نمود (پیوست ۱). با داشتن اطلاعات وزن مولکولی پلاسمید و غلظت پلاسمید استخراج شده (ng/µl) اکنون می توانید تعداد نسخه های پلاسمید در واحد حجم را به دست آورید.

 

 

 

 پروتکل آزمایشگاهی

 

 

جهت انجام همسانه‌سازی از پلاسمید pTZ57R/T که از محتویات کیت InsTAcloneTM ساخت شرکت Fermantas می‌باشد استفاده می شود..

۲-۱- تهیه محیط کشت باکتری

به منظور کشت باکتری DH5α در طول انجام مراحل همسانه‌سازی از سه نوع محیط کشت استفاده می شود: الف) محیط کشت LB مایع؛ ب) محیط کشت LB آگار؛ ج) محیط کشت انتخابی LB-آگار حاوی آمپی‌سیلین. طرز تهیه ‌این محیط‌های کشت به شکل زیر می باشد:

الف) محیط کشت LB مایع[۷]: برای تهیه یک­لیتر از این محلول، ۱۰ گرم تریپتون، ۵ گرم عصاره مخمر و ۱۰ گرم کلرید سدیم با آب مقطر به حجم یک لیتر رسانیده می شود (در صورت استفاده از پودر آماده LB برای آماده سازی هر لیتر از این محیط کشت ۲۵ گرم نیاز است) و جهت استریل کردن آن از اتوکلاو در دمای °C‌۱۲۱ و فشار ۲/۱ اتمسفر برای مدت زمان ۲۰ دقیقه استفاده می شود. پس از خنک شدن، محلول تا زمان استفاده در دمای ˚C 4 نگهداری شود. چنانچه جهت کشت از فالکون استفاده می کنید بهتر است قبل از اتوکلاو محلول را در داخل فالکون ریخته و بوسیله فالکون اتوکلاو شود. در هنگام قرار دادن فالکون در اتوکلاو اطمینان حاصل کنید که در فالکون به اندازه یک پیچ باز می باشد.

ب) محیط کشت LB-آگار: به‌این منظور قبل از انجام اتوکلاو پودر آگار در غلظت نهایی ۵/۱ درصد با محلول LB (آماده سازی طبق مرحله قبل) مخلوط می شود و قبل از اتوکلاو کمی حرارت دهید تا محلول گردد. پس از اتوکلاو وقتی دمای محلول به حدود °C‌۴۵ رسید در زیر هود به درون پلیت‌ها ریخته شود و پس از خنک شدن در یخچال نگهداری شود.

ج) محیط کشت LB-آگار حاوی آمپی‌سیلین: جهت تهیه محیط­های کشت انتخابی به محلول فوق قبل از اضافه کردن به پلیت‌ها به ازای هر میلی‌لیتر محلول مورد نیاز مقدار µg50 آمپی­سیلین به محلول اضافه می شود. آمپی­سیلین قبلاً با غلظت mg/ml 100 در آب مقطر حل شود و در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد نکهدار شود.

  • نکته: هر گاه با باکتری کار می کنید سعی کنید از مواد و وسایل اتوکلاو شده استفاده کنید و قبل از شروع کار میز کار و دستان خود را با الکل ۷۰ درصد ضد عفونی و در نزدیکی شعله کار کنید.

۲-۲- کشت خطی و کشت مایع باکتری DH5α

جهت تولید سلول‌های مستعد برای دریافت پلاسمید نوترکیب نیاز به باکتری‌های جوان می‌باشد. به‌این منظور از استوک باکتری DH5α بر روی محیط کشت LB-آگار کشت خطی تهیه می شود و به صورت ON در داخل انکوباتور با دمای °C‌۳۷ انکوبه می شود. روز بعد یک پرگنه باکتری کشت داده شده به داخل ۳ میلی‌لیتر محیط کشت LB مایع (اتوکلاو شده در داخل فالکون) تلقیح می شود و به صورت ON در داخل انکوباتور شیکر‌دار در دمای °C‌۳۷ با rpm 180 انکوبه می شود.

۲-۳- تهیه سلول‌های مستعد

در این مرحل ابتدا از باکتری های کشت داده شده بر روی محیط جامد فاقد آنتی بیونیک نمونه برداری کرده و کشت محلول با توجه به روش ذکر شده (۱-۲ ) کشت محلول نهیه می کنیم. پس از گذشت مدت مورد نیاز (۱۶ ساعت) باکتری های کشت داده شده را در کنار شعله با نسبت ۱ به ۴۹ با محیط LB اتوکلاو شده در داخل ظرف استریل شده (متناسب با مقدار مورد نیاز، ارلن، فالکون یا میکروتیوب) اضافه کرده و به مدت ۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد در انکوباتور شیکردار (rpm200)  انکوبه می کنیم (در این مرحله ۱۲۰ میکرولیتر از مایع کشت داده شده را به ۶ میلی لیتر LB اتوکلاو شده در داخل فالکون اضافه کنید). پس از گذشت زمان مورد نیاز به مدت ۲۰ دقیقه نمونه ها را بر روی یخ سرد می کنیم (قبل از سرد کردن به دلیل استفاده از سانتریفیوژ مخصوص میکروتیوب های ۵/۱ در ادامه کار محلول حاصل را به میکروتیوب های ۵/۱ منتقل کنید).

در مرحله بعد می بایست باکتری ها را با استفاده از سانتریفیوژ به مدت ۵ دقیقه در دور rpm 4000 پلت کنیم. پس از انجام سانتریفیوژ مایع روئی را بیرون ریخته و به باکتری های رسوب داده شده مقادیر ۱ میلی لیتر  کلرید منیزیم ۱۰۰ میلی مولار ( دقت شود این محول باید کاملا سرد باشد) اضافه می کنیم و با عمل پیپتینگ به نحو خیلی آرام محیط را یک دست می کنیم. دوباره عمل سانتریفیوژ را همانند مرحله قبل اجرا می کنیم. در مرحله بعد پس از دور ریختن مایع روئی (سعی کنید مقدار کمی از محلول کلرید منیزیم بر روی رسوب باقی بماند). مقدار ۱ میلی لیتر کلرید کلسیم ۱۰۰ میلی مولار (سرد) به رسوب اضافه کرده و به آرامی با عمل پیپتینگ محیط را یک دست کرده نمونه ها را به مدت یک ساعت بر روی یخ قرار می دهیم.

پس از گذشت مدت زمان مورد نظر نمونه ها را همانند مرحله قبل سانتریفیوژ کرده و در کنار شعله مایع روئی را به نحوی خارج می کنیم که در حدود ۱۰۰ میکرولیتر از مایع روی رسوب باقی بماند سپس به نمونه ها ۴۰ میکرولیتر گلیسرول مایع (قبلاً اتوکلاو شده و سرد شده باشد) اضافه کرده و پس از پیپتینگ کردن مخلوط به دست آمده را  در دمای ۷۰- درجه سانتیگراد نگهداری کنید. اضافه کردن گلیسرول به منظور حفاظت از باکتری ها در مقابل یخ زدگی می باشد. نمونه ها را می توان به مدت زمان ۱ ماه در فریزر و به مدت ماهها در دمای ۷۰- نگهداری کرد. می توان به منظور تست راندمان باکتری های مستعد شده ۱۰۰ میکرو لیتر از آنها را بر روی کشت آگار کشت داد تا از سالم بودن باکتری ها اطمینان حاصل شود.

۲-۴- واکنش پیوند (لیگاسیون)

طبق پیشنهاد کیت مورد استفاده برای همسانه­سازی، نسبت بهینه بین محصولات PCR به پلاسمید ۳ به ۱ می­باشد. به منظور برآورد تقریبی غلظت محصولات PCR از نشانگر وزنی SM0323 100bp Plus ساخت شرکت Fermentas استفاده شد. با استفاده از روش تخمین مشاهده‌ای بر طبق دستورالعمل نشانگر وزنی مذکور غلظت محصولات PCR برآورد شد. در نهایت برای تهیه محلول لیگاسیون مواد زیر در یک میکروتیوب با هم مخلوط و در دمای °C‌۱۶ به مدت چهار ساعت انکوبه شوند:

پلاسمید                      µl 5/1

قطعه رقابتگر                 µl 1

بافر ۵x لیگاسیون            µl 3

آب دیونیزه                   µl 5/14

آنزیم T4                     µl 5/0

  • نکته: معمولاً آنزیم ها نسبت به گرم شدن بسیار حساس اند. سعی کنید آنزیم را در همان زمان که نیاز دارید از فریزر برداشته و سپس فوری به محیط فریزر برگردانده شود.

جهت حصول اطمینان از عدم وجود آلودگی و همچنین اطمینان یافتن از صحت عمل لیگاسیون، یک واکنش لیگاسیون دیگر به نام کنترل منفی بدون اضافه کردن قطعه رقابتگر طرح‌ریزی کنید. انتظار می‌رود باکتری­های دریافت ‌کننده محصول این واکنش همگی بر روی محیط LB-آگار حاوی آمپی‌سیلین و مخلوط IPTG و XGal تولید پرگنه­های آبی‌ رنگ کنند. وجود پرگنه­های سفید رنگ در محیط کشت کنترل منفی به منزله وجود آلودگی و همچنین عدم وجود هر گونه پرگنه می­تواند مبنی بر عدم موفقیت آمیز بودن واکنش لیگاسیون یا عدم انجام صحیح پروسه ترانسفورماسیون باشد.

۲-۵- انتقال پلاسمیدها به باکتری (ترانسفورماسیون)

ابتدا سلول های مستعد را به مدت ۱۰ دقیقه به منظور خروج از یخ زدگی بر روی یخ قرار داده سپس مقادیر ۵ تا ۱۰ میکرولیتر از محصول واکنش اتصال را در کنار شعله به سلول های مستعد اضافه کرده و پس زدن چند ضربه آرام انگشت به تیوب (به منظور مخلوط شدن) میکروتیوب ها را به مدت ۴۰ دقیقه مجددا بر روی یخ قرار می دهیم ( در این مدت پلاسمید ها به شدت به سطح باکتری می چسبند).

در مرحله بعد به منظور ایجاد شوک حرارتی نمونه ها را به مدت ۹۰ ثانیه داخل حمام آب گرم با دمای ۴۲ درجه سانتیگراد قرار داده و بلافاصله پس از گذشت زمان مورد نظر به مدت ۵ دقیقه بر روی یخ قرار می دهیم. پس از گذشت زمان مورد نظر مقادیر ۱ میلی لیتر محلول استریل شده LB را در کنار شعله به نمونه ها اضافه کرده و به مدت زمان یک ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد در انکوباتور شیکر دار انکوبه می کنیم.

در مدت زمان انکوباسیون می توان محلول های تهیه شده IPTG و X-Gal را به محیط کشت جامد حاوی آنتی بیوتیک اضافه کرد. برای این منظور بر روی هر پلیت در کنار شعله ۴۰ میکرولیتر IPTG و ۴۰ میکرولیتر X-Gal ریخته و با پیپت پاستور با دقت قطره ها پخش کرده و به منظور جذب شدن محلول ها مورد نظر به مدت ۱۵ دقیقه پلیت ها را به صورت وارونه در محیط اتاق قرار می دهیم.

  • نکته: بهتر است محیط ها را جهت هم دما شدن با دمای رشد باکتری ها در انکوباتور قرار دهید.
  • نکته: سعی کنید محلول IPTG و X-Gal را به خوبی در همه جای محیط کشت پخش کنید تا در صورت مشاهده پرگنه های سفید مطمئن باشید که پرگنه به علت عدم وجود IPTG و X-Gal رنگ سفید نشان نداده است.
  • نکته: محیط های کشت قدیمی به علت اینکه مقداری از آب خود را از دست داده اند ممکن است به محض اضافه کردن محلول IPTG و X-Gal آن را جذب کنند و به خوبی نتوانید آن را پخش کنید لذا سعی کنید حتی المقدور از محیط های کشت تازه استفاده کنید.

پس از گذشت مدت ۱ ساعت انکوباسیون نمونه ها را در دور rpm 3000 به مدت ۸ دقیقه سانتریفیوژ می کنیم. مایع روئی را در کنار شعله خارج کرده به نحوی که ۲۰۰ میکرو لیتر بر روی رسوب باقی بماند سپس با عمل پیپتینگ به آرامی رسوب حاصله را مخلوط می کنیم.

در مرحله بعد، از نمونه ترانسفورماسیون شده ۱۰۰ میکرو لیتر در پلیت های حاوی آنتی بیوتیک- IPTG-X-gal پخش کرده و به مدت ۱۶ الی ۱۸ ساعت نمونه ها را در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه می کنیم. برای مطمئن شدن از راندمان کار می توان مقادیر ۱۰۰ میکرولیتر از نمونه ترانسفورم شده را بر روی محیط کشت جامد LB کشت (پخش کنید) داد.

. روش تهیه محلول های IPTG و X-Gal

تهیه محلول ایزوپروپیل D-B تیوگالاکتوپیرانوزید(IPTG)

این ماده در غلظت ۱/۰ مولار تهیه می شود. لذا ۲۴ میلی گرم از پودر آن را در ۱ میلی لیتر آب مقطر حل نموده، سپس از فیلتر عبور داده و در حجم های کم تقسیم بندی و در شرایط تاریکی (با فویل آلمینیومی پوشانده شوند) در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری شود. پایداری این مایع در این شرایط به مدت ۲-۴ ماه می باشد.

تهیه ۵ برمو-۳کلرو-اتیدولیل D-B گالاکتوزید (X-Gal)

این محلول با غلظت ۲۰ میلی گرم بر میکرولیتر در N-N دی متیل فرمامید حل و سپس در مقادیر کم تقسیم بندی و در شرایط تاریکی (با فویل آلمینیومی پوشانده شوند) در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری شود. پایداری این مایع در این شرایط به مدت ۲-۴ ماه می باشد.

 

۲-۶- غربالگری پرگنه‌‌ها

پس از انکوبه کردن محیط­های کشت به صورت ON محیط­های کشت برای مدت زمان ۱ ساعت به جهت تفکیک شدن کامل پرگنه‌های سفید و آبی به خاطر عمل آنزیم بتاگالاکتوزیداز در یخچال قرار دهید.

نکته: چنانچه پرگنه های رشد کرده به میزان کافی رشد نکرده اند اجازه دهید تا مدت زمان بیشتری را در انکوباتور سپری کنند.

پرگنه‌های سفید رنگ تولید شده (حاوی پلاسمید نوترکیب) در محیط کشت حاوی باکتری­های نوترکیب که به اندازه کافی رشد کرده و از سفید بودن رنگ آنها اطمینان به عمل آمده انتخاب کنید و به صورت خطی در محیط کشت انتخابی جدید به صورت ON کشت دهید.

۲-۷- استخراج پلاسمید نوترکیب

۲-۷-۱- استخراج پلاسمید از روش دستی

این روش توسط سمبروک و همکاران، (۱۹۸۹) ارایه شده است و با اندکی تغییرات به شرح زیر می توانید اقدام کنید:

۱۵۰۰ میکرولیتر از محیط کشت مایع باکتری نوترکیب که به مدت ۱۶ ساعت در دمای ˚C 37 در داخل انکوباتور شیکردار انکوبه شده بود به میکروتیوب انتقال داده و سپس به مدت ۸ دقیقه در rpm ۸۰۰۰ سانتریفیوژ کنید. پس از آن محلول رویی را خارج کرده و میکروتیوب را به صورت وارونه بر روی دستمال کاغذی قرار گرفتند تا رسوب حاصل کاملاً خشک گردد. مقدار ۲۰۰ میکرو‌لیتر از محلول شماره یک (سرد) به میکروتیوب‌ها اضافه کنید و پس از ورتکس، به مدت ۱۰ دقیقه روی یخ قرار دهید.

مقدار ۳۰۰ میکرو‌لیتر محلول ۲ را که به صورت تازه تهیه شده بود به میکروتیوب‌ها اضافه کنید و با چند مرتبه سر و ته کردن میکروتیوب مخلوط کنید و به مدت ۵ دقیقه بر روی یخ قرار دهید.

مقدار ۴۰۰ میکرولیتر محلول ۳ به صورت سرد به مخلوط داخل میکروتیوب‌ها اضافه کنید و پس از چندین مرتبه سر و ته کردن دوباره میکروتیوب را برای مدت زمان ۲۰ دقیقه روی یخ قرار دهید.

پس از افزودن این محلول‌ها به ترتیب در سه مرحله به مدت زمان‌های ۱۵، ۱۵ و ۱۰ دقیقه میکروتیوب‌ها در rpm 12000 در دمای ˚C 4 سانتریفیوژ کنید و در انتهای هر مرحله محلول رویی را به میکروتیوب‌های جدید انتقال یافت. در انتها حدود ۹۰۰ میکرولیتر محلول شناور در میکروتیوب‌ها باقی ماند که به صورت دو قسمت مساوی به میکروتیوب‌های جدید انتقال دهید و دو برابر حجم تقسیم شده به هر میکروتیوب ایزوپروپانول سرد اضافه کنید و به مدت یک ساعت در دمای اتاق قرار دهید. سپس به مدت ۱۵ دقیقه در rpm 12000 در دمای ˚C 4 سانتریفیوژ کنید و محلول رویی را به خوبی خارج و رسوب را با یک میلی‌لیتر اتانول ۷۰ درصد شستشو و میکروتیوب‌ها به مدت ۵ دقیقه در rpm ۸۰۰۰ در دمای ˚C 4 سانتریفیوژ کنید. سپس اتانول را تخلیه و برای خشک کردن کامل رسوب میکروتیوب‌ها را به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق بر روی کاغذ صافی قرار دهید. در انتها به رسوب باقیمانده میزان ۲۵ میکرولیتر آب دوبار تقطیر اضافه کنید و برای حذف RNA از آنزیم RNase استفاده کنید (۲/۰ میکرولیتر آنزیم RNase به ۸۰ میکرولیتر حجم پلاسمید استخراجی اضافه کنید و به مدت ۶۰ دقیقه در دمای ˚C 37 انکوبه کنید و در نهایت برای غیر فعال سازی آنزیم به مدت ۱۰ دقیقه در دمای °C‌۶۵ انکوبه کنید).

طرز تهیه محلول‌های شماره یک، دو و سه در زیر ارائه شده است:

محلول ۱: مواد زیر با هم مخلوط شده، و به حجم ۳۰ میلی‌لیتر رسانده و پس از اتوکلاو در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری کنید:

گلوکز؛              mM 50                  gr 297/0

تریس-HCl ؛      ۸pH= ، mM 25        gr 118/0

EDTA؛            ۸pH= ، mM 10        gr 112/0

محلول ۲: مواد زیر با هم مخلوط شده و به حجم ۵ میلی‌لیتر برسانید. این محلول بصورت تازه تهیه و مصرف شود:

NaOH؛            N 4                       µl 250

SDS؛               ۱۰%                       µl 500

محلول ۳: مواد زیر با هم مخلوط شده و به حجم ۳۰ میلی‌لیتر رسیده شود و تا زمان استفاده در یخچال نگهداری شود:

استات پتاسیم       M 5                       ml 18

اسید استیک                                     ml 45/3

 

۲-۷-۲- استخراج پلاسمید با استفاده از کیت Roche

 

 

۲-۸- تعیین کیفیت و کمیت پلاسمید نوترکیب استخراج شده

جهت تعیین غلظت DNA نمونه­ها از دستگاه نانودراپ استفاده کنید.

 

همچنین می توانید جهت مشاهده پلاسمید استخراج شده از الکتروفورز ژل آگارز استفاده کنید:

روش تهیه بافر TBE

برای تهیه ۱۰۰ میلی لیتر TBE 10X، ۷۸/۱۰ گرم تریس (Tris base) به همراه ۷۴/۰ گرم  EDTA در ۵۰ میلی لیتر آب دوبار تقطیر درون ارلن ریخته و ارلن  را روی هیتر قرار داده. بعد از گرم شدن محتویات ارلن و حل شدن کامل مواد، ۵/۵ گرم اسید بوریک را در ۴۰ میلی لیتر آب دوبار تقطیر حل کرده و به محتویات ارلن اضافه می کنیم تا ۱۰۰ میلی لیتر TBE 10X حاصل شود.

آماده سازی ژل آگارز

. ژل باکس را برای ریختن ژل آماده کرده و شانه ها را جهت ایجاد چاهک درون ژل باکس قرار می دهیم. برای تهیه ژل آگارز ۱% مقادیر ۲۰ میلی لیتر (بسته به حجم باکس مورد استفاده)  TBE 1Xرا درون ارلن ریخته و ۲/۰ گرم آگارز به آن اضافه می کنیم. ارلن ۳۰ ثانیه در داخل مایکروویو قرار داده و بعد از گرم شدن محتویات درون ارلن و حل شدن کامل آگارز ارلن از مایکروویو خارج می کنیم در این مرحله آگارز آماده شده بایستی شفاف باشددر مرحله بعد به ژل آگارز ۲ میکرولیتر اتیدیوم بروماید اضافه کرده و با  احتیاط به هم می زنیم. ژل آگارز را داخل ژل باکس ریخته به نحوی که قطر لایه آگارز ۱ تا ۲ میلی متر باشد.

بعد از بسته شدن آگارز (تقریبا ۲۰ تا ۲۵ دقیقه) با احتیاط به طوری که ژل ضربه نبیند، شانه خارج گردیده و ژل باکس رابه همراه ژل در داخل تانک الکتروفورز افقی قرار می دهیم. بافر TBE1X را در داخل تانک الکتروفورز ریخته به نحوی که  ۲ تا ۳ میلی لیتر از سطح ژل آگارز را بگیرد. مقدار ۵ میکرولیتر از نمونه (پلاسمید استخراج شده) را با ۱ میکرولیتر Loading Buffer  به داخل چاهک های ژل منتقل کرده و تانک الکتروفورز را به جریان برقی با اختلاف پتانسیل ۸۰ میلی ولت به مدت زمان ۲۰ تا ۳۰ دقیقه وصل می کنیم. پس از گذشت زمان مورد نظر ژل باکس همراه ژل جهت بررسی نمونه ها در زیر لامپ UV قرار گرفته و باندهای احتمالی را مشاهده می کنیم.

  • نکته: در شرایط ایده آل الگوی سه باندی مشاهده شده در نتیجه استخراج پلاسمید مربوط به اشکال مختلف پلاسمید مانند سوپر‌کویل[۸]، خطی[۹] و حلقوی[۱۰] می‌باشد

 

 

پیوست ۱

برخی از سایت های اینترنتی مفید

NEB cutter:                             http://tools.neb.com/NEBcutter2/

Oligo calc:                               http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html

 

ابزار های رایگان طراحی پرایمر

Primer Quest                           http://eu.idtdna.com/scitools/scitools.aspx

Primer 3.0                               http://frodo.wi.mit.edu/primer3/

FastPCR                                 http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm

Oligo Explorer                        http://www.genelink.com/tools/gl-oe.asp

PerlPrimer                               http://perlprimer.sourceforge.net/

PrimerX                                   http://bioinformatics.org/primerx/

 

ابزارهای تجاری طراحی پرایمر

Oligo 6.0                                 http://www.oligo.net/

Vector NTI                             http://www.invitrogen.com/site/us/en/home.html

DNAStar                                http://www.dnastar.com/

ProbeITy                                 http://www.celadonlabs.com/

Primer Premier                        http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/

Scorpio                                   http://www.dnasoftware.com/

 

 

 

[۱] – Concatmer

[۲] – Reverse Transcriptase

[۳] – Multiple Cloning Site

[۴] – Electroporation

[۵] – Nucleic acid gun

[۶] – Micro Injection

[۷] – LB Broth

[۸] – Supercoiled

[۹] – Nicked

[۱۰] – Open Circle

برچسب ها

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

بستن