گروه آموزشی دکتر نوری

جامع ترین وبسایت منابع و جزوات کارشناسی ارشد و دکتری گروه زیست شناسی و علوم پزشکی

dr.nouri در بهمن - ۱۱ - ۱۳۹۶

در دهه اخیر با ظهور تکنولوژی توالی یابی نسل جدید(Next Generation Sequencing. NGS) توالی یابی ژنها و تشخیص بیماری های ژنتیکی وارد عرصه جدیدی شده است. با استفاده از این تکنیک این امکان فراهم گردیده تا در خصوص تشخیص علت ژنتی. بسیاری از بیماریها و سندروم ها از جمله اختلالات و ناهنجاریهای مادرزادی که قبلا بواسطه محدودیتهای تکنیکهای مورد استفاده تحت عنوان “با علل نامعلوم “بیان می گردید، مشخص شود. در واقع تکنولوژی NGS از یکسری روشها متشکل از اما ده سازی اولیه و قطعه قطعه کردن نمونه ژنوم مورد مطالعه، توالی یابی، تصویر برداری و مرئی سازی، سرهم کردن قطعات توالی یابی شده و آنالیز دادهها میباشد. از کاربردهای این روش نوین میتوان به بهبود چشمگیر در تشخیص بیماریهای ژنتیکی، تشخیص ژنتیکی پیش از لانه گزینی، فارماکوژنومیکس، اپی ژنتیک و شناسایی تنوعات ساختاری در ژنوم اشاره نمود. در این نوشتار ضمن معرفی تکنیک NGS، اهمیت و کاربرد روز افزون آن در تشخیص مولکولی بیماری های ژنتیکی به طور اجمالی بررسی می شود.

آشنایی با تاریخچه روش های توالی یابی ژنوم و DNA

در دهه ۱۹۷۰، سنگر و همکاران و همچنین ماکسام و گیلبرت روشهایی برای توالی یابی DNA توسط تکنیکهای خاتمه زنجیره و تکه تکه شدن ارائه دادند. در این بین به سبب این که روش سنگر، نیاز به دست ورزی و استفاده کمتر از مواد شیمیایی سمی و رادیو ایزوتوپ نسبت به روش ماکسام و گیلبرت داشت، به عنوان روش تعبین توالی اصلی انتخاب شد و این امر علم زیست شناسی را متحول نمود (۱). اما وجود معایبی در روشهای توالی یابی نسل اول از جمله محدودیت های داخلی در توان عملیاتی، مقیاس پذیری، سرعت و تفکیک پذیری و هزینه ها سبب کندشدن دسترسی محققان به اطلاعات اساسی مورد نیاز شده بود. لذا برای غلبه بر این موانع و همچنین نیاز رو به رشد به توالی یابی ژنوم فردی به صورت سریع، کم هزینه و دقیق لزوم تغییر از روش سنتی تعیین توالی سنگر به سمت استفاده از تکنولوژی جدید یا “توالی یابی نسل جدید (NGS) وجود داشت. این فن آوری اساسا رویکردی متفاوت در توالی یابی است که تا کنون منجر به کشفیات متعددی شده و تحولی بزرگ در علوم ژنومیک پدید آورده است.

توالی یابی نسل جدید (NGS) چیست

تکنیک NGS همچنین به عنوان روش سنگر خودکار و یا توالی یابی انبوه موازی (MPS) در سال ۲۰۰۶ معرفی شد (۲). در واقع این واقعیت که رمزگشایی ژنوم انسان سرنخهای مهمی درباره ژنتیک بیماری ها و همچنین توسعه پیشگیری تخصصی تر را فراهم می نماید، استراتژی های تشخیصی و درمانی را در دهه گذشته به طور گستردهای معطوف استفاده از تعیین توالی و نقشه برداری ژنومی کرده است (۳).

چگونگی عملکرد توالی یابی نسل جدید نسل جدید توالی یابی سه بهبود عمده نسبت به نسل قبلی دارد:

۱) به جای نیاز به شبیه سازی باکتریایی قطعات DNA، مبتنی بر تهیه کتابخانههای NGS در یک سیستم مستقل از سلول میباشد،

۲) در آن میلیونها واکنش توالی یابی به موازات هم انجام میشوند

۳) خروجی تعیین توالی به طور مستقیم و بدون نیاز به الکتروفورز نمایان میشود (۴).

به طور کلی این نوع توالی یابی در سه مرحله انجام می شود. در مرحله اول نمونه ژنومی (DNA یا cDNA) به کتابخانهای از قطعات کوچک تقسیم می شود و در ادامه آداپتورها (الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی با توالی شناخته شده) بر انتهای این قطعات متصل خواهد شد. سپس این کتابخانهها تکثیر شده تا برای توالی یابی آماده شوند (۵). مرحله دوم که تعیین توالی و تصویر برداری میباشد، بر مبنای ساخته شدن و تولید قطعات است و طی آن هر کدام از قطعات کتابخانه به عنوان یک واحد ژنومی الگو عمل کرده و رشتههای جدیدی را ایجاد می کنند. در حال حاضر انواع مختلفی از تعیین توالی نسل جدید توسط کمپانی های ژنومیکس عرضه شده است. در جدول شماره ا تعدادی از روشهای مزبور با روش سنگر مقایسه شدهاند.

جدول ۱. مقایسه انواع روش های تعیین توالی در توالی یابی نسل جدید (NGS)

جدول ۱. مقایسه انواع روش های تعیین توالی در توالی یابی نسل جدید (NGS)

فرآیند توالی یابی طی یک چرخه شست و شو و مجاور شدن قطعات حاصله با مجموعه ای از نوکلئوتیدهای شناخته شده که به ترتیب توالی قرار می گیرند، دنبال میشود. در حالی که این نوکلئوتیدها به دنبال یکدیگر متصل می شوند تا دنباله ای را ایجاد کنند، توالی مذکور به صورت دیجیتالی ثبت شده که این مکانیسم شناسایی اطلاعات توالی بنا به نوع تکنیک می تواند براساس تغییرات PH و یا نور فلورسانس باشد (۱). در مرحله سوم تحلیل دادهها صورت می پذیرد. دادههای توالی خام باید تحت چند مرحله تجزیه و تحلیل قرار گیرند که این تجزیه و تحلیل داده ها شامل حذف توالی آداپتور و توالیهای کم کیفیت، و نقشه برداری از داده ها با استفاده از یک ژنوم مرجع شناخته شده (توالی یابی مجدد) و یا در غیاب ژنوم مرجع (توالی یابی جدید) می باشند. تجزیه و تحلیلی بعدی شامل طیف گستردهای از ارزیابی های بیوانفورماتیکی از جمله تنوع ژنتیکی برای تشخیص SNP”ها و جهش ها (درج یا حذف بازها)، تشخیص ژن جدید و یا عناصر تنظیمی، ارزیابی سطح بیان ژن، شناسایی جهش در سلولهای سوماتیک و جنسی را شامل شود که ممکن است به تشخیص بیماری ژنتیکی منجر گردد (۷). مراحل انجام تکنیک NGS در شکل ۱نشان داده شده است.

شمایی از مراحل کلی از مراحل انجام توالی یابی نسل جدید

شمایی از مراحل کلی از مراحل انجام توالی یابی نسل جدید

مرحله اول تشکیل کتابخانه ژنومی، مرحله دوم تعیین توالی و تصویربرداری بر مبنای سنتز و مرحله سوم تجزیه و تحلیل داده ها.

دسته بندی : مطالب کلی

يک ديدگاه بگذاريد


گروه آموزشی دکتر نوری