مطالب علمی

سنجش بیان ژن با روش میکرواری (microarray) و آنالیز سریالی بیان ژن (SAGE )و RNA-seq و کاربرد آن ها در علوم زیستی

سنجش بیان ژن با روش میکرواری (microarray) و آنالیز سریالی بیان ژن (SAGE )و RNA-seq و کاربرد آن ها در علوم زیستی

امروزه ابزارهای آزمایشگاهی پیشرفته در علم ژنتیک مولکولی و نرمافزارهای کامپیوتری وابسته جهت آنالیز دادههای حاصل، سبب گسترش در علم پیوانفورماتیک شده که به طور فزاینده در سایر شاخه های علوم زیستی نفوذ کرده است. بیوانفورماتیک در زمینه های مختلف به همراه روشهای آزمایشگاهی سبب پیشرفت در موضوعات علوم زیستی خصوصاً بیان ژن شده است. از آنجایی که در پیان ژن از محصول به ماده اولیه میرسیم این تکنولوژی امکان طراحی الگوریتم یا مدلسازی را پر اساسی وقایع اتفاق افتاده طی پیان ژن در اختیار قرار می دهد. روشهای مختلفی جهت بررسی پیان ژن از قبیل لکه گذاری نورترن، هیبریداسیون درجا (in situ hybridization)، رونوشت بردار معکوس ، شناسایى توالى رونویسى شده، ریزآرایه (microarray)، آنالیز سریالى بیان ژن، و RNA-Seq موجود است که هرکدام فواید و معایب منحصر به فردى دارند.

آشنایی با روش های بررسی بیان ژن ها به صورت جمعی (highthroughput)

در دهه ۱۹۵۰ نقش اساسی RNA در ترجمه در قالب نظریه اساسی مولکولی، توسط جیمز واتسون مطرح شد. این نظریه از آنجا نشأت گرفت که در سلولهای یوکاریوتی، DNA درون فضای هسته محصور است ولی پروتئینها در فضای سیتوپلاسمی و در حضور RNAهای فراوان ساخته میشوند. با در نظر گرفتن نقش DNA و حضور آن در هسته و نیز کد شدن این اطلاعات در قالب پروتئین در سیتوپلاسم، حضور مولکول های واسطه ای به نام RNA مطرح شد(۵). داده های بیان ژن اطلاعات ارزشمندی در مورد شبکه های بیولوژیک، حالات سلولی و فهم عملکرد ژنها ارائه می دهد. یک هدف از تحلیل داده بیان ژن تعیین چگونگی تأثیر بیان هر ژن منفرد بر روی بیان ژنهای دیگر در همان شبکه ژنتیکی است و هدف دیگر مشخص کردن این نکته است، که چگونه ژنها در سلولهای سالم و بیمار بیان می شوند. در علم پزشکی پروفایل بیان ژن در مدیریت و کنترل بیماریهای عفونی و مقایسه بیان ژن در سلولهای سالم و سرطانی کاربرد عملی دارد (۲۱). از جمله روش های مورد استفاده در تحلیل داده های بیان ژن شامل نرمال سازی، خوشه بندی، طبقه بندی و غیره است (۲۸). واحدی و همکاران (۲۰۰۸)، با خوشه بندی داده های بیان ژن در بیماران سرطانی آنها را در ۲ گروه جداگانه با دقت بالا جای دادند که بیشترین نزدیکی با اطلاعات واقعی حاصل شد. بیان ژن و ارتباط آن با چند شکلی های ژنی می تواند در پاسخ افراد به داروها نیز مطرح باشد. به عنوان متال ژن MDR۱ که به طور طبیعی در بسیاری از بافت های بدن انسان از قبیل مغز، کلیه، کبد، ماهیچه و روده بیان شده و نقش حفاظت این بافت ها را در برابر مواد سمی دارد (۲۰)، سبب مقاومت دارویی در سلول -های سرطانی نیز می شود. تاکنون بیش از ۵۰ چند شکلی تک نوکلئوتیدی (SNP) در آن گزارش شده که در حدود ۲۰ مورد از آنها جهشهای خاموش هستند (۲۷). اگرچه در تحقیقات سامانیان و محجوبی (۲۰۱۲)، ارتباطی بین بیان ژن MDR۱ و چندشکلی های موجود یافت نشد.

امروزه تکنولوژی های توالی یابی با توان بالا به طور رایج در بیولوژی استفاده می شوند. این تکنولوژی ها میلیونها توالی از قطعات شکسته شدهی ژنوم با اندازه های ۹۵ جفت باز (Read) جهت اتصال به آداپتور را تولید میکنند که در پروژه های ژنوم، اپی ژنوم و ترانسکریپتوم (کل RNA کد شونده و غیر کد شونده) استفاده می شوند (۱۱). توسعه ی تکنولوژی های توالی یابی با توان زیاد، نقش در کاهش هزینه و به دنبال ان افزایش سریع در بازده توالی یابی داشته، اگرچه خطاهای توالی یابی برخی خوانش ها با طول کوتاه هنوز قابل توجه است. این چالش ها نیاز فوری به الگوریتم – های بیوانفورماتیکی مؤثر با سیستم تأثیرگذار دارد که مقادیر بالایی داده توالی یابی ترانسکریپتوم تولید نماید و مطالعات مرتبط با تنوع را نیز انجام دهد. استراتژی های تحلیلی مرتبط بر توالی یابی ترانسکریپتوم شامل نقشه یابی خوانش ها با طول کوتاه، شناسایی محل اتصال اسپلایسینگ اگزون – اگزون، کمیت بیان ژن یا ایزوفرم های آن، تجزیه و تحلیل بیانی متفاوت و نوسازی ترانس کریپتوم است (۳).

روش های سنجش میزان بیان ژن ها

بیوانفورماتیک و فناوری های جدید، روش های بیولوژیکی سنتی را دچار تحول کرده است. تلفیق ابزارهای محاسباتی و دستگاه های پیچیده مهندسی، زمینه را برای کشف حیطه های ناشناخته خاصی همچون ژنتیک بیش از پیش فراهم کرده است (۲۸). روشهای ابتدایی در آنالیز بیان ژن از قبیل لکهگذاری نورترن، هیبرید اسیون درجا، رونوشت بردار معکوس و شناسایی توالی رونویسی شده EST بازده پایین و محدودیت کارایی در تعداد زیاد ژن دارند (۱۷). از جمله فن آوری های نوین حاصل از تلفیق بیوانفورماتیک و روشهای بیولوژیکی در حوزه استفاده از داده های بیان ژن روش ریزآرایه، SAGE (آنالیز سریالی بیان ژن) و (Sequencing RNA (RNA Seq است.

معرفی تکنیک میکرواری (microarray) یا ریزآرایه و کاربردهای آن در سنجش بیان ژن ها

در دهه گذشته، با توانایی به مطالعه در اطلاعات ژنتیکی ژنوم در دامنه گسترده، ریزآرایه ها روشی با توان عملیاتی بالا به منظور تجزیه و تحلیل های بیان ژن به حساب آمدند (۱۷). ظهور فن آوری نوین ریز آرایه را می توان در سال ۱۹۹۵ دانست. با استفاده از این تکنیک میتوان به طور همزمان بیان هزاران ژن را در حداقل زمان ممکن انجام داد و در سالهای اخیر موجب تولید حجم انبوهی از دادههای بیان ژنی شده است. این روش هر توالی ژنی شناخته شده به عنوان یک کاوشگر روی یک آرایه شیشه ای یا نایلونی تبت می شود. mRNA استخراج شده از بافت یا نمونه خون بارنگ های فلورسنت علامت گذاری می شود و کاوشگرها با RNA مکمل بر روی یک آرایه هیبرید می شوند.

انواع میکرواری (microarray) چیست

دو نوع آرایه با بیشترین کاربرد عبارتند از:

آرایه بر پایه DNA مکمل (Complementary DNASpotted)
آرایه بر پایه الیگونوکلئوتید (Oligo nucleotide array)

آنالیز ریز آرایه محدودیت های خاصی دارد که از آن جمله میتوان عدم توانایی در شناسایی رونوشت های جدید، دامنه ی محدود، تکرارپذیری دشوار و عدم انجام مقایسه بین ازمایش های مختلف به علت خطاهای تصادفی و معمول محققان و آزمایشگاه ها را نام برد (۱۹). برای آنالیز داده های ریز آرایه می توان از شبکه هایی موسوم به شبکه بیانی ژن GCNS استفاده کرد. این شبکه برای انواع وسیعی از مسائل بیولوژی مانند نقش اترات متقابل بین پروتئینها، کشف جایگاه اتصال فاکتور رونویسی و مدل سازی اثرات متقابل ژنتی به کار برده می شود. چندین ابزار برای تصویرسازی و آنالیز شبکه های بیولوژی از جمله VisAnt، cytoscapeو tYNA استفاده می شود.

مراحل انجام روش میکرواری (microarray) چیست

در شکل زیر مراحل تکنیک ریز آرایه برای شناسایی و بیان ژن در سلولهای سالم و بیمار ارائه شده است.

معرفی تکنیک میکرواری (microarray) یا ریزآرایه و کاربردهای آن در سنجش بیان ژن ها

ابتدا DNA مورد نظر (که می تواند همان cDNAهای تکثیر شده از mRNA استخراج شده باشد) توسط مواد فلورسنتی نشاندار می شوند و سپس بر روی لام مخصوص ریزآرایه دو رک گیری می شود. پس از نشاندار شدن مولکولهای CDNA عملیات شستشو انجام گرفته تا اتصالات غیر اختصاصی جدا شود در مرحله بعد تشعشع فلورسنتی مربوط به اتصالات اختصاصی توسط دستگاه ثبت می گردد که میزان روشنایی که بیانگر میزان بیان است توسط نرم افزار مربوطه محاسبه و آنالیز آماری انجام میشود.

آموزش آنالیز سریالی بیان ژن (SAGE )و کاربردهای آن در بررسی بیان ژن ها

جهت آنالیز بیان ژن در مقیاس گسترده می توان از تکنیک قدرتمندی به نام آنالیز سریالی بیان ژن ( SAGE) استفاده نمود. این تکنیک امکان بررسی وسیع رونوشتهای RNA را بدون داشتن اطلاعات اولیه از ترانس کریپتوم آن فراهم می کند. SAGE کتابخانه بزرگی از توالیهای الیگونوکلئوتیدی کوتاه (tag) با منشأ ImRNA فراهم می آورد که از بافت یا سلول خاص استخراج شده است. توالی هر tag برای جستجوی آن در پایگاه اطلاعاتی کافی است و فراوانی هر agا به طور مستقیم نشان دهنده فراوانی رونوشت مربوطه است. از کاربردهای SAGE میتوان بررسی تغییرات ترانس کریپتوم در مسیرهای مربوط به سرطان، بررسی اثرات دارو بر بافت های مورد بررسی، دیابت و پارکینسون، در مطالعات گیاهی، در تعیین تفاوت بیان ژن در نمونه هایی که تحت شرایط پاتولوژیکی و فیزیولوژیکی مختلف قرار گرفته اند، شفاف ساختن مسیرهای مختلف سلولی، کمک به شناسایی مسیرهای ایجاد بیماری، شناسایی ژنهای جدید و با فراوانی کم، تکمیل سایر مطالعات بیان ژن، شناسایی اهداف پایین دست آنکوژنها و ژن های مهارکننده ی تومور را نام برد .

آموزش مراحل انجام آنالیز سریالی بیان ژن (SAGE )

آموزش آنالیز سریالی بیان ژن (SAGE )و کاربردهای آن در بررسی بیان ژن ها

در شکل فوق مراحل تکنیک SAGE آورده شده است.

در این تکنیک mRNA استخراج شده به CDNA دو رشتهای تبدبل و با آغاز کرهای متصل به استریتاویدین تثبیت می شود. هضم با آنزیم محدودالدور اول (AE) امکان اتصال به ۳ نوع لینکر از بیش طراحی شده به نام A و B را فراهم می آورد سپس هضم با آدریم محدوداللار دوم ( TE) و مخلوط نمودن ۳ و اکدش با همدیگر توسط آنزیم لیگاز الجام میگیرد، مولکولهای حاصله در ۳ انتها دارای لینکر متغاوست (A و B) و در وسط دارای ۳ قطعه توالی با شلاسه (Tag) مربوط به رنهای رونویسی شده میباشدد که آنها را ۳شداسه با DITa8 مینامند، در مرحله بعد تکثیر توسط PCR، هضم آنزیمی و والکلشر انصال سوم منجر به تولید پلیمرهای شلاسه (ConcatanleTS) می شود که همساله سازی و سپس توالی بابی میشود. در نهایت آنالیز توالی یا شناسه ها توسط ذرم افزارهای مربوطه بیانگر میزان بیان آنها در سلول مورد مطالعه است.

مقایسه روش آنالیز سریالی بیان ژن (SAGE) و میکرواری (microarray)

تفاوت روش SAGE و ریز آرایه در آنالیز بیان ژن (۱، ۲۲) عبارتند از: روش ریز آرایه، نیازمند آگاهی اولیه از توالی ژن مورد نظر است. در حالی که SAGE نیازی به آگاهی اولیه ی ژنوم ارگانیسم ندارد.

در ریز ارایه نواحی مختلف رونوشت و ترکیب بازها جهت هیبریداسیون تعیین کننده است ولی در تکنیک SAGE ناحیه ی ۳ اگزون، هدف ردیابی است و حضور آنزیم محدود کننده در این جایگاه جهت رها شدن برچسب از الگو تعیین کننده است.

نحوه شناسایی در ریزآرایه بر پایه سیگنالهای فلورسانس و شدت آنها است ولی در SAGE بر پایه تعیین کمی رونوشت است.

اطلاعات ریز آرایه نسبت به SAGE پیچیده تر است.

SAGE نسبت به تکنیک ریز آرایه قابلیت تعیین دقیق فراوانی mRNA و نشان دادن تفاوت های اندک در سطح بیان ژن بین نمونه ها را دارد.

معمولا تکنیک SAGE جهت فراهم نمودن اطلاعات اولیه از ترانسکریپتوم استفاده و سپس ریز آرایه ها این اطلاعات را گسترش و در تعداد نمونههای بیشتری به کار می گیرد.

اطلاعات SAGE مشابه روش RNA-Seq دیجیتالی است در نتیجه در روش SAGE امکان مقایسه بین کتابخانه ها به سهولت انجام میگیرد ولی در روش ریزآرایه همان طور که در بالا اشاره شد امکان مقایسه بین آزمایش های مختلف آن وجود ندارد.

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

بستن