ساختمان DNA , همانند سازی DNA در یوکاریوت و پروکاریوت + فیلم
ساختمان رشتهای DNA
سرعت پیشرفت تعیین ساختمان DNA بسیار کند بوده است. در سال ۱۹۳۰ کاسل و لوین دریافتند که نوکلئین در واقع اسید دزوکسی ریبونوکلئیک است. برسیهای شیمیایی آن مشخص کرد که زیر واحد تکرار شونده اصلی DNA ، نوکلئوتید میباشد که از سه قسمت تشکل شده است. یک قند پنتوز (۲- دزوکسی D- ریبوز) ، یک گروه ۵-فسفات و از یکی چهار باز آلی نیتروژندار حلقوی آدنین (A) ، گوانین (G) ، سیتوزین (C) و تیمین (T) تشکیل شده است.
از این چهار باز دو باز آدنین و گوانین از بازهای پورینی و دو باز سیتوزین و تیمین از بازهای پیریمیدینی میباشند. به مجموعه قند و باز آلی نوکلئوزید گفته میشود. گروه فسفات میتواند به کربن۳ و یا۵ متصل شود. به مجموع نوکلئوزید و گروه فسفات متصل به آن نوکلئوتید میگویند. با توجه به اینکه یون فسفات میتواند هم به کربن ۳ و هم به کربن۵ متصل شود.
پس دو نوکلئوتید از طریق یک پیوند فسفودی استر بهم متصل میشوند. به این صورت که گروه هیدروکسیل یک نوکلئوتید با گروه فسفات نوکلئوتید دیگر واکنش داده و پیوند فسفودی استر را بوجود میآورد. از آنجایی که پیوند فسفودی استر ، کربنهای۳ و۵ دو قند مجاور را بهم متصل میکند، این پیوند را پیوند۵-۳ فسفودی استر نیز مینامند. یک زنجیره در اثر اتصال پشت سر هم تعدادی۲-دزوکسی ریبونوکلئوتید بوسیله پیوندهای دزوکسی ریبونوکلئوتید تشکیل میشود.
تمامی نوکلئوتیدها در یک زنجیره پلی نوکلئوتیدی دارای جهت یکسان میباشند. به این صورت که نوکلئوتید انتهایی در یک سمت زنجیره دارای یک گروه۵ آزاد و نوکلئوتید انتهایی در سمت دیگر زنجیره دارای یک گروه۳ آزاد میباشد. بنابراین زنجیره پلی نوکلئوتیدی دارای جهت بوده و این جهت را به صورت۵—>3 نشان میدهند. بنابراین اگر در نوکلئوتید ابتدایی کربن۵ در بالای حلقه پنتوز و کربن۳ در زیر آن باشد، در تمامی نوکلئوتیدهای بعدی زنجیره کربن ۵ در بالای حلقه پنتوز جای خواهد داشت.
نتایج حاصل تا سال ۱۹۵۰
DNA یک پلیمر رشتهای متشکل از واحدهای۲- دزوکسی اسید ریبونوکلئیک میباشد که بوسیله پیوندهای فسفودی استر۵-۳ به هم متصل شدهاند.
DNA حاوی چهار زیر واحد dc و dG و dT و dA میباشد.
مقادیر متوالی dT و dA با یکدیگر و dc و dG نیز با یکدیگر مساوی میباشند.
مارپیچ دو رشتهای DNA
در سال ۱۹۵۳ در ساختمان سه بعدی DNA ، بوسیله واتسون و کریک کشف شد. واتسون و کریک با استفاده از مطالعات تفرق اشعه ایکس ، رشتههای DNA که بوسیله فرانکلین و ویلکینز تهیه شده بود و همچنین ساختن مدلها و استنباطهای مشخصی ، مدل فضایی خود را ارائه دادند و در سال ۱۹۶۲ واتسون و کریک و ویلکینز به خاطر اهمیت کشف ساختمان DNA به صورت مشترک جایزه نوبل دریافت کردند.
مدل پیشنهادی آنان چنین بود. DNA یک مارپیچ دو رشتهای است که رشتههای آن به دور یک محور مرکزی ، معمولا به صورت راست گرد پیچ میخورند. طبق مدل واتسون و کریک ، ستونهای قند – فسفات همانند نردههای پلکان به دو قسمت خارجی بازهای آلی پیچیده و به این ترتیب در معرض محیط آبکی داخل سلول هستند و بازهای آلی که خاصیت آبگریزی دارند، در داخل مارپیچ قرار میگیرند. هنگام تشکیل مارپیچ رشتهها به صورت موازی متقابل قرار میگیرند.
یعنی اگر جهت یک رشته۳<–5 باشد، رشته دیگر ۵<–3 خواهد بود. پیوندهای هیدروژنی بین آدنین از یک رشته با باز تیمین رشته مقابل و باز گوانین یک رشته با سیتوزین رشته مقابل بوجود میآیند. گر چه از نظر اندازه هر باز پورینی میتواند در مقابل یک باز پیریمیدین قرار بگیرد. ولی به دلیل وجود گروههای شیمیایی روی بازهای G و C و T و A پیوندهای هیدروژنی مناسب فقط بین C – G و T – A برقرار میشود و ایجاد پیوند بین T – G و C- A ممکن نیست.
واکنشهای توتومریزاسیون
اتم هیدروژن در بازهای آلی میتواند روی اتمهای نیتروژن و یا اکسیژن حلقه جابجا شود. این تغییر موقعیت هیدروژن روی حلقه باز را توتومریزاسیون میگویند. توتومریزاسیون در بازهای آدنین سیتوزین باعث تبدیل فرم آمینی به فرم ایمنی و در مورد بازهای تیمین و گوانین باعث تبدیل فرم کتونی به فرم انولی میشود.
در شرایط فیزیولوژیکی ثابت تعادل واکنش توتومریزاسیون بیشتر به سمت اشکال آمینی و کتونی میباشد. این حالت پایدار پروتونی ، الگوی تشکل پیوندهای هیدروژنی بین بازها را تعیین مینماید، بطوری که بازهای T و A با تشکیل دو پیوند هیدروژنی و بازهای G و C با سه پیوند هیدروژنی با هم جفت میشوند. C و A و همچنین T و G نمیتوانند با هم جفت شوند.
زیرا در این بازها اتمهای هیدروژن هر دو در یک موقعیت قرار دارند و امکان ایجاد پیوند هیدروژنی وجود ندارد. به دلیل اینکه در رشتههای DNA همواره باز A مقابل T و باز G مقابل C قرار دارد، این دو رشته را مکمل مینامند. بنابراین توالی موجود در یک رشته DNA ، توالی رشته مقابل را تعیین میکند. مکمل بودن دو رشته DNA ، اساس عمل همانند سازی DNA است.
همانندسازی DNA
در مطالعات اولیه برای همانندسازی سه الگو مطرح شد که شامل الگوهای حفاظتی ، نیمه حفاظتی و پراکنده است. در الگوی حفاظتی از روی مارپیچ دو رشتهای DNA ، یک مولکول کامل DNA ساخته میشود. در الگوی نیمه حفاظتی ابتدا دو رشته DNA از هم باز شده و در مقابل هر یک از رشتهها ، رشته مکمل ساخته میشود. در الگوی پراکنده ابتدا مولکول DNA به قطعاتی تقسیم میگردد و هر یک از قطعه رشته مکمل خود را سنتز میکند. واتسون و کریک با پژوهشهای خود بر روی مولکول DNA ، الگوی نیمه حفاظتی را منطقی و تنها راه همانند سازی میدانستند. سپس مزلسون و استال با انجام آزمایشهای بسیار ظریف و مهم ، درستی چنین الگویی را به اثبات رساندند.
آزمایش مزلسون و استال
مزلسون و استال برای اثبات فرآیند همانند سازی آزمایشی انجام دادند که به شرح زیر میباشد. آنها ابتدا یاختههای باکتری اشرشیاکلی را در محیط کشت ویژهای که نیتروژن آن از نوع سنگین (N15) بود، برای زمان معین کشت دادند و سپس یاختهها را به محیط کشت عادی که نیتروژن آن از نوع سبک (N14) بود، انتقال دادند و در محدودههای زمانی معین از یاختههای نسلهای اول ، دوم و سوم حاصل از محیط کشت جدید ، نمونه برداری کرده و DNA آنها را به روشهای اختصاصی جدا ساختند. نمونههای DNA بر روی گرادیان (شیب) چگالی کلرور منیزیم سانتریفوژ شده و در این روش ترکیبات مختلف بر اساس چگالی آنها جدا سازی میشوند.
بدین ترتیب DNA واجد وزنهای متفاوت از یکدیگر جدا میشوند. DNA معمولی که N14 دارد (DNA سبک) به علت داشتن چگالی کمتر در بالای لوله قرار میگیرد. در حالی که مولکول DNA با (N15 سنگین) در محلی پایین تر از DNA سبک واقع میشود. DNA های واجد مقادیر متفاوت N15 و N14 نیز در بینابین این دو حد جای میگیرند.
با کشت یاختههای دارای DNA واجد نیتروژن سنگین در محیط کشت حاوی نیتروژن سبک مشاهده میشود که مولکول DNA ماهیت سبک – سنگین پیدا میکند. یعنی دو رشته DNA کاملا از هم باز شده و رشتههایی در تکمیل هر یک از دو رشته قبل ساخته میشود. این رشتههای جدید همگی دارای نیتروژن سبک (محیط کشت جدید) هستند. با ادامه کشت در نسلهای دوم و سوم ملاحظه میشود که از میزان DNA سبک – سنگین کم شده و به DNA سبک افزوده میشود.
نتیجه آزمایش مزلسون و استال
مزلسون و استال با چنین مشاهداتی نتیجه گرفتند که همانند سازی در مولکول DNA به طریق نیمه حفاظتی صورت میگیرد که مستلزم باز شدن دو رشته از هم و سنتز مولکول DNA جدید در مقابل هر رشته قدیم است. این پدیده به نام همانند سازی مشهور است.
آنزیمهای لازم در همانند سازی
آنزیمهای پلیمراز
آنزیمهایی هستند که پلیمر شدن زنجیرههای پلینوکلئوتیدی را کاتالیز میکنند. تا کنون سه نوع آنزیم پلیمراز به نامهای Ι و ΙΙ و ΙΙΙ جداسازی و مشخصات آنها ارائه شدهاند. از بین آنها آنزیم پلیمراز ΙΙΙ نقش اصلی را در سنتز DNA دارد. از خصوصیات مهم آن ، این است که منحصرا نوکلئوتیدها را در جهت ‘۵ به ‘۳ بهم متصل میکنند و در جهت عکس نمیتواند عمل کند. آنزیم پلیمراز ΙΙ نیز در مرحلهای از سنتز DNA وارد شده و سنتز را در جهت ‘۳ به ‘۵ پیش میبرد. و آنزیم پلیمراز I عمل ترمیم همانند سازی را انجام میدهد.
آنزیم هلیکاز
این آنزیم به مولکول DNA دو رشتهای متصل شده و با عمل خود موجب باز شدن دو رشته از یکدیگر میشود.
آنزیم لیگاز
در مرحلهای از سنتز DNA وارد عمل شده و دو رشته DNA را بهم پیوند میدهد.
آنزیم پریماز
آنزیمی است که در ساختن قطعه کوچک RNA پرایمر ، هنگام همانند سازی وارد عمل شده و نوکلئوتیدهایی از نوع اسید ریبونوکلئوتید را به یکدیگر متصل میکند. تعدادی پروتئینهای ویژه وجود دارند که پس از باز شدن دو رشته DNA از یکدیگر به محلهای باز شده متصل شده و مانع اتصال مجدد دو رشته به یکدیگر میشوند.
همانند سازی متوالی
در روی مولکول DNA نقاطی وجود دارند که همانند سازی از آنها آغاز میشود. این نقاط مبدا همانند سازی خوانده میشوند. در DNA باکتریها ، یک مبدا همانند سازی و در DNA موجودات عالی ، تعدادی زیادی از این مبدا وجود دارند. هنگام همانند سازی ابتدا آنزیم هلیکاز به مارپیچ دو رشتهای DNA متصل شده و پیچش DNA را در آن نقطه باز میکند. پرتئینهای DBP به ناحیه باز شده هجوم آورده و با اتصال به DNA تک رشتهای مانع از جفت شدن بعدی DNA میشوند.
ناحیهای را که هلیکاز به آن متصل میشود، چنگال همانند سازی مینامند. همانند سازی به صورت دو سویه است. آنزیم پلیمراز ΙΙΙ که اتصال نوکلئوتیدها را به یکدیگر به عهده دارد، فقط میتواند همانند سازی را در جهت ۳ به ۵ پیش ببرد. در این حالت دو رشته مولکول DNA در خلاف جهت یکدیگر هستند. در نتیحه رشتهای که در جهت ‘۵ به ‘۳ سنتز میشود، به راحتی سنتز DNA را آغاز کرده و پیش میبرد. این رشته به نام رشته راهنما معروف است. در همانند سازی این رشته را متوالی مینامند.
همانند سازی نامتوالی
در مولکول DNA رشتهای که ‘۵ آزاد دارد، سنتز DNA طبق آنچه درباره رشته راهنما ذکر شد، انجام نمیگیرد. دلیل آن این است که آنزیم پلیمراز ΙΙΙ نمیتواند نوکلئوتیدها را در جهت ۳ به ۵ کاتالیز کند. لذا میبایست مکانیسم دیگری برای سنتز این رشته از DNA وجود داشته باشد. این رشته DNA به نام رشته عمل کننده یا پیرو معروف است. در این حالت ابتدا دو رشته DNA در فواصل معینی از یکدیگر باز شده و آنزیم پریماز در آن محل قرار میگیرد و با استفاده از ریبونوکلئوتیدها ، RNA کوچکی ساخته میشود که RNA پرایمر نام دارد.
انتهای ۳ این RNA کوچک که از روی الگوی DNA ساخته شده است، میتواند به آنزیم پلیمراز III امکان دهد تا دزاکسی ریبونوکلئوتیدها را به انتهای آن متصل کند. لذا در این رشته از مولکول DNA قطعاتی از DNA سنتز میشوند که قطعات اوکازاکی نام دارد. (اوکازاکی نخستین کسی بود که این قطعات سنتز شده DNA را با میکروسکوپ الکترونی مشاهده کرد).
در این حالت آنزیم پلیمراز I وارد عمل شده و به ترتیب یکی یکی ریبونوکلئوتیدها را در جهت ۵ به ۳ برداشته و به جای آنها نوکلئوتیدهای از انواع دزاکسی جایگزین میکند تا این که قطعات همه از نوع دزاوکسی شوند. سپس انتهای قطعات ساخته شده بوسیله آنزیم لیگاز به هم متصل شده و یک رشته ممتد DNA حاصل میشود. اندازه هر قطعه اوکازاکی حدود ۱۰۰۰ تا ۲۰۰۰ نوکلئوتید است.
T-DNAچیست؟
اساس مولکولی انتقال ژنتیکی به گیاهان توسط آگروباکتریوم انتقال یک منطقه از یک پلاسمید بزرگ القا کننده تومور (Ti) یا ریشهزا (Ri)[1] از آگروباکتریوم و ادغام آن در ژنوم گیاه میباشد
- A) T-DNA به سه ناحیه T-DNA چپ (TL)، T-DNA مرکزی (TC) و T-DNA (TR ) راست تقسیم میشود. دایرههای توپر سیاه نشانه توالیهای تکراری حاشیه T-DNA هستند. oriV نقطه شروع همانندسازی پلاسمید Ti با دایره توخال نمایش داده شده است.
- B) رونوشتهای متنوع رمزشده توسط T-DNA در پلاسمید Ti و جهت رونویسی آنها با بردارها نمایش داده شده است. ژنها رمزکننده فعالیتهایی شامل ساخت اکسین (auxin)، ساخت سایتوکینین (cyt)، مانوپین[۲] (mas) و آگروپین[۳] (aga) نشان داده شدهاند.
اندازه پلاسمید Ti 200 تا ۸۰۰ کیلو باز است. T-DNA یا DNA منتقل شونده در منطقه T[4] بر روی پلاسمید Ti یا Ri قرار دارد. اندازه منطقه T در پلاسمیدهای طبیعی Ti و Ri حدوداً ۱۰ تا ۳۰ کیلو باز است. بنابراین، منطقه T عموماً ۱۰ درصد پلاسمید Ti را شامل میشود. برخی پلاسمیدهای Ti یک منطقه T داشته و برخی دارای چند منطقه T میباشند. فرآیند انتقال T-DNA از پلاسمید Ti و ارسال آن از باکتری به سلول گیاهی حاصل فعالیت ژنهای بیماریزا (vir) میباشد که توسط پلاسمید Ti حمل میشوند.
منطقه T با توالیهای حاشیهای T-DNA معین میشود. این حاشیهها ۲۵ جفت باز طول دارند و از نظر توالی بسیار همسان هستند. آنها منطقه T را با تکرارهای هم جهت از دو طرف در بر گرفتهاند. به طور کلی، کنارههای T-DNA حدود آن را تعیین میکنند (البته موارد استثنایی نیز وجود دارد که به آنها اشاره خواهد شد)، چون این توالیها هدف اندونوکلئازهای اختصاصی کنارهها یعنی VirD1/VirD2 که T-DNA را Ti plasmid جدا میکنند، میباشند. به نظر میرسد که یک قطبیت در کنارههای T-DNA وجود دارد به طوری که در ابتدا به نظر میرسد کناره راست بسیار مهمتر از کناره چپ است. عوامل متعددی باعث ایجاد این قطبیت میشوند. اول اینکه توالیهای حاشیهای فقط به عنوان هدف اندونوکلئاز VirD1/VirD2 عمل نمیکنند بلکه به عنوان یک محل اتصال کووالانت به پروتئین VirD2 نیز عمل میکنند. در پلاسمید Ti و Ri (یا در ناقلهای دوتایی[۵] T-DNA) کنارههای T-DNA باعث به هم وصل شدن DNA دورشتهای میشود. شکستن این توالیهای کنارهای دورشتهای شده هم در شرایط in vivo و هم in vitro، نیازمند پروتئیهای VirD1 و VirD2 میباشد، هرچند در شرایط in vitro پروتئین VirD2 به تنهایی میتواند یک توالی تک رشتهای حاشیهای T-DNA را ببرد. شکتن توالی حاشیهای ۲۵ جفت بازی T-DNA عمدتاً با ایجاد شکافی در “رشته پایینی” T-DNA به طور قراردادی، بین نوکلئوتید ۳ و ۴ صورت میگیرد. شکستن دورشتهای نیز در کنارههای T-DNA گزارش شده است. ایجاد شکاف در توالی حاشیهای با پیوستگی محکم (شاید کووالانت) پروتئین VirD2 از طریق تیروزین موقعیت ۲۹ با انتهای ۵′ مولکول تکرشتهای حاصل از T-DNA که رشته T[6] خوانده میشود، همراه است. این رشته T است که به جای مولکول دورشتهای T-DNA، به سلول گیاهی منتقل میشود. در این حالت، این پروتئین VirD2 است که به حاشیه راست متصل شده (مستقیماً به خود توالی حاشیه متصل نمیشود) و باعث ایجاد قطبیت و اهمیت حاشیه راست نسبت به حاشیه چپ میشود. ذکر این نکته لازم است که چون شکاف در حاشیه چپ نیز برای اتصال VirD2 به بقیه مولکول لازم است (قسمت غیر T-DNA پلاسمید Ti یا ناقل دوتایی T-DNA)[7]، این موضوع ممکن است باعث فرآیند جداسازی رشته T از پلاسمید Ti یا پلاسمید Ri و ناقلین دوتایی T-DNA باشد. مشکل انتقال “بقیه قسمتهای”۴ ناقل به گیاه در ادامه شرح داده خواهد شد.
دوم اینکه شاید حضور توالیهای overdrive T-DNA نزدیک به حاشیه راست بسیاری از T-DNAها، نیز به ایجاد قطبیت بین حاشیه چپ و راست کمک نماید. توالیهای overdrive باعث تقویت انتقال رشته T به گیاهان میشوند، گرچه هنوز سازکار مولکولی این موضوع ناشناخته است. گزارشهای اولیه حاکی از این است که پروتئین VirC1 به توالی overdrive متصل میشود و شاید بریده شدن حاشیه T-DNA توسط اندونوکلئاز VirD1/VirD2 را تقویت کنند. عمل VirC1 و virC2 برای بیماریزایی بسیار مهم است و جهش این دو ژن باعث عدم بیماریزایی در بسیاری از گونههای گیاهی میشود. اما گزارشهایی ارائه شده که تولید T-DNA در جهشیافتههای ژن virC آگروباکتریوم را در سطح گونه وحشی دانستهاند. بنابراین هر گونه اثر virC پس از پردازش T-DNA رخ میدهد.