اصول رنگ آميزي گرم (Gram staining):
رنگآمیزی گرم یکی از مهم ترین و متداولترین روشهای رنگ آمیزی در علم میکروب شناسی است که برای اولین بار در سال ۱۸۸۴ توسط پزشک و میکروب شناس دانمارکی بنام هانس کریستین گرم (Hans Christian Gram ) موقع رنگ آمیزی برای متمایز کردن باکتریهای مولد ذات الریه از هسته سلولهای میزبان ابداع شد . این رنگ آمیزی که مهمترین و کاربردی ترین رنگ آمیزی افتراقی میکروب شناسی است . در حالت کلی باکتری ها را به دو دسته یا گروه بزرگ گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می کند در سال ۱۹۲۱هوکر (George J. Hucker) میکروب شناس آمریکایی با اصلاحات جزئی در روش رنگ آمیزی گرم ارتقاء و بهبود این روش شد. در آزمايشگاه ميكروب شناسي باليني، رنگ آميزي گرم آزمايشي مهم براي تشخيص احتمالي سريع عوامل عفوني است. اين آزمايش براي طبقه بندي باكتري ها بر اساس شكل، اندازه، مورفولوژي سلول و واكنش گرم آنها به كار مي رود.
اساس روش رنگ آمیزی گرم، ناشی از تفاوت ساختاری در یوارة سلولی باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت است. به این ترتیب که ضخامت لايه پپتيدوگليکان (ترکيب اصلی ديواره سلولی) در باکتریهای گرم مثبت خیلی بیشتر از باکتریهای گرم منفی می باشد لذا اساس رنگ آمیزی گرم به ساختمان و ترکیب دیواره سلولی باکتری بستگی دارد . در این روش ابتدا رنگ بازی کریستال ویوله بکار می رود که همة باکتریهای کشته شده و تثبیت شده بر روی لام آن را جذب می نمایند و سپس محلول رقیق ید به عنوان دندانه (Mordant) افزوده می شود که رسوبی از کمپلکس کریستال ویوله و ید در پروتوپلاسم تشکیل می دهد. در مرحلة بعدی رنگ آمیزی وقتی که از رنگبر استفاده می شود در باکتری های گرم مثبت ساختار شیمیایی اصلی دیواره، یعنی پپتیدوگلیکان، لایه ای ضخیم است و پس از متراکم شدن در اثر آبگیری با رنگبری، نفوذناپذیر شده و مانع از خروج کمپلکس کریستال ویوله و ید از سلول می شود. ولی در دیوارة سلولهای گرم منفی، پپتیدوگلیکان لایه ظریفی از دیواره را تشکیل می دهد و بقیة دیواره از جنس چربی هاست که در رنگبر حل شده و از بین می رود و لذا امکان رخنه افزایش یافته و کمپلکس کریستال ویوله ید به راحتی از پروتوپلاسم شسته شده و از سلول خارج می شود. تا بدین مرحله گرم منفی ها بی رنگ شده و گرم مثبت ها همچنان بنفش باقی مانده اند.
در مرحلة پایانی رنگ آمیزی، از رنگ ثانویه یا رنگ مخالف (Counterstain) استفاده می شود و باکتری های گرم منفی که کمپلکس رنگی خود را از دست داده اند در نتیجة افزودن رنگ قرمز سافرانین، قرمز رنگ می شوند )گرم منفی(. ولی باکتری هایی که در اثر افزودن رنگبر (Decolorizer)، رنگ خود را از دست نداده اند با افزودن رنگ سافرانین، همچنان رنگ قبلی یعنی بنفش را نگه داشته و نشان می دهند )گرم مثبت(..
اکثر باکتریهای شناخته شده ، گرم منفی هستند البته برخی از باکتریها ، مخمرها و تعدادی از کپکها گرم مثبت هستند.
تفسير گسترش هايي كه رنگ آميزي گرم شده اند، با در نظر گرفتن مشخصه هاي رنگ آميزي ، اندازه، شكل و آرايش سلول صورت می گيرد. اين مشخصه ها ممكن است بوسيله بسياري از فاكتورها مانند مدت زمان ماندگی باکتری در محيط کشت، نوع محيط کشت، اتمسفر انكوباسيون، روش رنگ آميزي و وجود مواد مهاركننده تحت تأثير قرار بگيرند. براي تفسير اسميرهاي تهيه شده از نمونه هاي باليني مانند خلط، به وجود عوامل اضافي مانند انواع سلول هاي ميزبان و فاگوسيتوز نيز می بايست دقت نمود .
| شکل ۴- تفاوت ساختاری دیواره سلولی باکتری های گرم منفی و گرم مثبت |
اسمير براي رنگ آميزي گرم ممكن است از نمونه هاي باليني، محيط براث يا كلني هاي رشد كرده روي محيط كشت جامد تهيه شود. نمونه هاي باليني تازه وكشت هاي تازه (كمتر از ۲۴ ساعت) از محيط هاي غيرمهاركننده ، صحيح ترين نتايج را مي دهند؛براي برخي بررسي هاي مورفولوژيكي، اسمير تهيه شده از كشت براث مورد نياز مي باشد.
- معرف ها و محلولهای مورد نیاز:
معرف ها ممكن است به صورت تجاري خريداري شوند يا در آزمايشگاه تهيه گردند.
- محلول كريستال ويوله
طرز تهیه:
- پودر کريستال ويوله ۲۰ گرم
- اتانول۹۶ درجه ۱۰۰ میلی لیتر
محلول ذخيره و مصرفی کريستال ويوله، در ظرف تيره و در دماي اتاق نگهداري ميشود.
تهيه اگزالات آمونيوم
- پودر اگزالات آمونيوم یک گرم
- آب مقطر ۱۰۰ میلی لیتر
هنگام مصرف، محلول کريستال ويوله ذخيره را به نسبت ۱:۱۰ با آب مقطر رقيق نماييد. (۱ میلی لیتر از محلول کريستال ويوله و ۹ میلی لیتر آب مقطر) سپس اين محلول را با چهار حجم از محلول اگزالات آمونيم رقيق کنيد (۱ میلی لیتر محلول کريستال ويوله رقيق شده و ۴ میلی لیتر اگزالات آمونيم).
- محلول لوگل
روش تهيه:
- يد ۱ گرم
- يدور پتاسيم ۲ گرم
- آب مقطر ۲۴۰ میلی لیتر
- محلول آبي بيکربنات سديم۵% ۶۰ میلی لیتر
- در مقدار کمي از آب مقطر، يد و يدور پتاسيم را کاملاً حل نماييد، بعد حجم را با آب مقطر به ۲۴۰ میلی لیتر برسانيد. محلول ۵% بيکربنات سديم (بيکربنات سديم: ۵ گرم در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر) را نيز به آن اضافه نماييد. محلول در دمای اتاق نگهداری می شود . درب آنرا بايد کاملا” محکم ببنديد.
احتياط: يد خاصيت خورندگي دارد. از استنشاق، خوردن يا تماس آن با پوست خودداري كنيد.
- رنگ بر
- الكل ـ استون
حجم مساوي از الکل اتيليک (اتانول) را با استون بسته به نیاز مخلوط نماييد. مثلا” مخلوطي از ml 100 اتانول و ml100 استون را در بطري شيشه اي قهوه اي رنگ تركيب كنيد، با يك سال تاريخ انقضاء، برچسب بزنيد و در حرارت اتاق نگهداري كنيد.
- رنگ متقابل یا رنگ ثانویه (Counterstains)
روش تهيه فوشين ذخيره:
- پودر فوشين ۲ گرم
- اتانول ۱۰۰ میلی لیتر
روش تهيه سافرانين ذخيره:
- پودر سافرانين ۵/۲ (دو ونیم ) گرم
- اتانول ۱۰۰ میلی لیتر
به هنگام مصرف، محلول ذخيره فوشين يا محلول ذخيره سافرانين را به نسبت ۱:۱۰ با آب مقطر رقيق نماييد. محلولها در ظروف تيره، تهيه و در دمای اتاق ذخيره می شوند.
- وسايل و مواد مورد نياز
- لام شيشه اي ( mm75×۲۵)
- NaCl 85/0% (سرم فیزیولوژی) استريل
- پي پت پاستور و اپليكاتور چوبي استريل
- لوپ ميكروب شناسي، آنس تلقيح سازي
- Safety box براي دور ريختن زباله بيولوژيك شامل وسايل نوك تيز
- روغن ايمرسيون
- متانول خالص
نكته: متانول را در بطري هاي درپيچ دار قهوه اي ذخيره كنيد. ذخيره كاري را مي توان در ظروف پلاستيكي براي حداكثر دو هفته ذخيره نمود .
- تجهيزات مورد نیاز با توجه به نوع نمونه:
- سانتريفوژ
- ورتكس
- لوله درپيچ دار استريل
- قيچي، اسكالپل و پنس استريل
- خردكن بافت
روش انجام آزمايش:
الف– تهيه گسترش :
اسمير مناسب بايد لايه اي از ارگانيسم ها با تراكم مناسب براي مشاهده آسان ايجاد نمايد. پراکندگی ارگانيسم ها می بايست به نحوی باشد که آرايش آنها مشخص شود. برای تهيه اسمير از لام هاي شيشه اي نو و تميز استفاده نماييد.
نكته: زماني كه از يك پي پت يا سواب براي تهيه اسمير و تلقيح محيط كشت استفاده مي كنيد، هميشه قبل از تهيه اسمير، ابتدا محيط كشت را تلقيح كنيد.
۱– نمونه های بالینی برای رنگ آمیزی گرم:
نكته : استفاده از دستكش لاتكس در زمان كار روي نمونه هاي باليني ضروري است .
- نمونه هاي دريافت شده با سواب
در اینگونه موارد بهتر است يك سواب جداگانه برای تهيه اسمير آماده شود .
الف- جهت جلوگيري از تخريب عناصر سلولي و از بين رفتن آرايش باكتريايي، به آرامي سواب را در سرتاسر لام بچرخانيد.
- در مواردي كه فقط يك سواب دريافت مي شود، سواب را در مقدار كمي سرم فیزیولوژی استریل قرار داده و آن را ورتكس كنيد. سواب را به ديواره داخلي لوله بفشاريد و آن را براي تهيه گسترش به كار ببريد. از باقيمانده سوسپانسيون براي تلقيح در محيط كشت استفاده كنيد.
نمونه هايي كه با سواب دريافت نمي شوند شامل: آسپيره ها، ترشحات، چرك، مدفوع
- اگر نمونه در يك سرنگ دريافت شده باشد، ابتدا تمامي آن را در يك لوله استريل بريزيد. در صورت كافي بودن حجم نمونه آن را ورتكس كنيد.
نكته: سرنگ هاي همراه سرسوزن را ، نپذيريد. به كاركنان مربوطه جداسازي ايمن سرسوزن ها را آموزش دهيد .
- با استفاده از يك اپليكاتور، پي پت يا لوپ سيمي استريل قسمت هاي چركي يا خوني نمونه را انتخاب كنيد. نمونه هاي خيلي غليظ يا نمونه هاي چركي را مي توان در يك قطره سرم فیزیولوژی استریل روي لام رقيق نمود تا تهيه اسمير آسان تر شود.
- نمونه را روي منطقه بزرگي از لام پهن كنيد تا يك لايه نازك ايجاد شود.
- نمونه CSF و ساير مايعات بدن كه نياز به سانتريفوژ دارند
بعضي از آزمايشگاهها ممكن است برای تغليظ مايعات بدن و تهيه اسمير از Cytopsin Slide Centrifuge استفاده كنند. اين روش به افزايش حساسيت رنگ گرم ،كاهش زمان سانتريفوژ و دسترسی سريعتر به نتيجه کمک می نمايد.
- بعد از انجام سانتريفوژ، با استفاده از پي پت استريل، محلول رويي را به يك لوله استريل منتقل كنيد، حدود ۵/۰ ملی لیتر را به عنوان رسوب باقي بگذاريد.
- رسوب را ورتكس كرده يا با چند بار داخل و خارج كردن از يك پي پت پاستور استريل آنرا كاملا مخلوط نماييد.
- با استفاده از پي پت پاستور يك قطره كوچك از رسوب را روي يك لام تميز قرار دهيد.
- قطره را پخش نكنيد. اجازه دهيد تا در مجاورت هوا خشك شود.
- نمونه هاي ادرار
بدون سانتریفوژ کردن نمونه را به خوبي مخلوط کرده با استفاده از يك پي پت پاستور استريل یک قطره از آن را روي لام قرار دهيد و قطره را پخش نكنيد. اجازه دهيد قطره در مجاورت هوا خشك شود.
مواد خشك يا مقادير خيلي كم نمونه هاي باليني:
- نمونه را در ۵/۰ میلی لیتر سرم فیزیولوژی استريل حل كنيد. در صورت نياز ورتكس نماييد.
- با استفاده از پي پت پاستور استريل یک قطره را روي لام قرار دهيد.
- با استفاده از نوك پي پت، قطره را پخش كنيد تا لايه نازكي ايجاد شود.
- بيوپسي ها و برش هاي بافت
تهيه نمونه حاصل از تماس مستقيم اسلايد با سطح نمونه (touch prep) و يا نمونه خرد شده (ground specimen)
- بافت را با استفاده از قيچي يا اسكالپل استريل خرد كنيد.
- نمونه اي حاصل از تماس مستقيم اسلايد با سطح نمونه (touch prep) تهيه كنيد. با استفاده از پنس استريل قطعه ها را نگه داريد و كناره هاي يك يا تعداد بيشتري از قطعات خرد شده را با اسلايد شيشه اي استريل تماس دهيد، براي بررسي آسانتر تماس ها را با هم دسته بندي كنيد.
- براي نمونه هاي تماسي يكنواخت، يك قطره را روي اسلايد قرار دهيد و به اندازه يك دايرهای به قطر ۵/۲ سانتي متري پخش كنيد.
- نمونه های برداشت شده از محیط های کشت:
- نمونه های برداشت شده از محیط های کشت براث:
پس از مخلوط کردن محیط کشت با استفاده از پي پت پاستور استريل (يا يك سوزن منفذدار، براي ظروفي مثل بطري هاي كشت خون، جهت جلوگيري از آلودگي با سرنگ) يك قطره از محیط کشت را روي لام قرار دهيد.
براي جلوگيري از مخلوط شدن نمونه هاي مختلف روي يك لام ، توصيه مي شود روي هر لام، يك گسترش تهيه شود.
- نمونه های برداشت شده از محیط های کشت جامد:
- يك قطره سرم فیزیولوژی استریل استريل روي لام قرار دهيد.
- مقدار كمي از كلني را با يك اپليكاتور، آنس يا لوپ استريل برداريد.
- به آرامي مخلوط كنيد تا سوسپانسيون يكنواختي حاصل گردد.
| شکل ۵- نحوه تهیه گسترش از محیط کشت مایع |
ب- فيكس كردن گسترش:
مطابق روشهای که قبلا” توضیح داده شده است.گسترش های تهیه شده را تثبیت و فیکس می کنیم.
ج- روش انجام رنگ آميزي گرم:
الف- روش هوکر Hucker’s modification
- رنگ آمیزی با کریستال ویوله : در این مرحله مقداری از رنگ کریستال ویوله را با قطره چکان به روی سطح گسترش میکروبی روی لام می ریزیم و می گذاریم یک دقیقه بماند تا رنگ در دیواره سلولی میکروبها نفوذ کند. پس از سپری شدن مدت زمان یک دقیقه ، رنگ اضافی روی لام را خالی کرده و با استفاده از آب شیر که با فشار کم در حال خارج شدن است، لام را به آرامي بشوئيد.
احتياط: شستشوي بيش از حد در اين مرحله مي تواند باعث شسته شدن كريستال ويوله از سلول هاي گرم مثبت شود. براي اطمينان از جريان آرام آب در سمت اسميردار لام، اسلايد را به صورت زاويه دار نگه داريد.
- مرحله اضافه کردن محلول ید : چند قطره از محلول ید را روی گسترش پخش نموده و می گذاریم بمدت یک دقیقه به همان حالت بماند . بعد محلول اضافی را خالی کرده و با آب شیر همانند مرحله قبل ، لام را شستشو دهید.
- مرحله رنگ بری با استفاده از الکل- استون : با استفاده از محلول رنگ بر الکل – استون که بر روی گستره می ریزیم بسرعت آنرا بی رنگ می کنیم. مرحله بی رنگ سازی ۲۰تا ۳۰ ثانیه باشد. بعد از آن لام را بسرعت می شوییم . این عمل ، بی رنگ شدن را متوقف خواهد کرد.
- رنگ آمیزی با سافرانین : در این مرحله سطح گسترش را با رنگ ثانویه یعنی سافرانین می پوشانیم و۳۰ ثانیه صبر می کنیم . بعد از آن رنگ اضافی را خالی کرده و با آب مقطر لام را شستشو می دهیم.
- خشک کردن: لام رنگ آمیزی شده را در وضعيت ايستاده در مجاورت هوا خشك كنيد. پشت لام را با استفاده از دستمال كاغذي آغشته به استون يا الكل پاك كنيد ولی کاغذ را روی گسترش نکشید.
- مشاهده و بررسی: مقداری از روغن را روی لام ریخته و لام را زیر میکروسکوپ بررسي و مشاهده می کنیم.
| شکل ۶- مراحل رنگ آمیزی گرم |
كنترل كيفي:
الف- روزانه معرف ها را از نظر ظاهري بررسي كنيد.
۱- اگر كريستال ويوله رسوب كرده يا ته نشين شده، قبل از استفاده آن را صاف كنيد، حتي زماني كه معرف ها به صورت تجاري خريداري مي شوند.
نكته: بعضي رنگ ها، خصوصاً فوشين بازي و سافرانين مي توانند آلوده شوند. در صورت شک به آلودگی ، انجام رنگ آميزی با استفاده از معرف تازه توصيه ميگردد .
۲- تبخير شدن مواد ممكن است كارايي و تأثير معرف ها را دگرگون كند. اگر محلول هاي كاري با مصرف روزانه تمام نمي شوند، بايد به طور منظم تعويض شوند.
ب- استفاده از سوش های استاندارد :
به طور روزانه در صورت زیاد بودن نمونه و یا زماني كه از يك کیت جديد و یا تازه تهیه شده استفاده مي شود، گسترشي از اشريشيا كلي (ATCC 25922) و استافيلوكوك اپيدرميديس (ATCC 12228) و يا استافيلوكوك اورئوس (ATCC 25923) تهيه و فيكس نموده و مطابق روش فوق رنگ آميزي كنيدو نتایج را بررسی نماید
نتايج مورد انتظار:
۱ – باسيل هاي گرم منفي، صورتي
۲- كوكسي هاي گرم مثبت، بنفش پررنگ
توجه: بعنوان روش كنترل كيفي جايگزين پيشنهاد ميشود با يك اپليكاتور چوبي از فلور میکروبی بين دندان ها نمونه برداری نموده و رنگ آمیزی نماییدزیرا در نمونه فوق الذکر هم ارگانيسم هاي گرم مثبت و هم گرم منفي وجود خواهد داشت.
گزارش نتايج در رنگ آمیزی گرم:
الف- نتايج و تفسير
۱- وضعيت كلي اسمير را با بزرگنمايي كم (۱۰× ) ارزيابي كنيد.
- دقت نماييد كه اسمير بطور مناسبي رنگ بري شده باشد. بسته به نوع نمونه، زمينه عموما” بايد شفاف يا صورتي باشد. اگر گلبول هاي سفيد در نمونه وجود دارد، بايدبه صورت گرم منفي ظاهر شوند. رسوب هاي نازك سوزني شكل كريستال ويوله را با باكتري هاي ميله اي شكل گرم مثبت اشتباه نگيريد.
- دقت نماييد ضخامت اسمير مناسب باشد. براي تفسير مناسب، گستره نمي بايستي بيش از يك سلول ضخامت داشته و روي هم افتادگي سلول ها نبايد مشاهده شود.
۲- اسميرهاي تهيه شده از نمونه هاي باليني را جهت بررسي موارد زير با بزرگنمايي كم بررسي كنيد:
- مقادير مربوط به نوتروفيل ها، مونوسيت ها و گلبول هاي قرمز
- مقادير مربوط به سلول هاي اپي تليال و باكتري هاي فلور نرمال كه ممكن است نشانگر جمع آوري نامناسب نمونه باشد.
- وضعيت و آرايش ميكروارگانيسم ها
۳- مناطق متعددي از اسمير را با روغن ايمرسيون از نظر وجود ميكروارگانيسم ها بررسي و به شيوه زير گزارش كنيد.
- در صورت عدم مشاهده هیچ گونه ميكروارگانيزم در لام تهیه شده :”هيچ ميكروارگانيسمي مشاهده نشد”.
- در صورت مشاهده ميكروارگانيزمها ، تراكم كلي و مرفولوژي را شرح دهيد.
۴- شكل سلولي غالب ميكروارگانيسم ها را ذكر نماييد
- شكل كلي: كوكسی، كوكوئيدی، كوكوباسيل، باسيل، رشته اي شكل، شبه مخمر
- ظاهر انتهاها: كروي، شمعي شكل، مسطح، گرزي شكل، مقعر. برآمدگی كناره ها مي تواند وجود اسپورها را پيشنهاد كند، اما مي تواند به علت واكوئل ها، پلئومرفيسم، يا رنگ آميزي نامنظم باشد.
- ظاهر كناره ها: موازي، تخم مرغي شكل (برآمده)، مقعر، نامنظم
- ماهيت محور تقارن: مستقيم، منحني، فنري
- پلئومرفيسم (ناپايداري در شكل): عبارت توصيفي “ديفتروئيد” يا “كورينه فرم” براي توصيف باسيل هاي گرم مثبت به كار مي رود كه چند شكلي، گرزي شكل يا نامنظم و بي قاعده هستند يا آرايش نرده اي يا زاويه دار دارند (اشكال VوL ).
- گسترش شاخه اي يا سلولي
ب- ثبت مشاهدات
هر آزمايشگاه بايد سياست گزارش دهي ويژه اي را تدوين كند. يافته هاي مهم باليني بايد جهت اطلاع به پزشك معالج اعلام شود.
براي نمونه ادرار ۲۰میدان میکروسکپی يا بيشتر را بررسي كنيد. اگر بطور ميانگين،ن يك ارگانيسم يا بيشتر در میدان میکروسکپی روغن ايمرسيون ديده مي شود، مثبت گزارش كنيد. اين امر با كلني كانت CFU/ml 105 ≤ همبستگي دارد.
مقادير مربوط به سلول ها و ميكروارگانيسم هاي مشاهده شده را گزارش دهيد.
ج- گزارش دهی رنگ آمیزی گرم:
معمولا” سيستم هاي گزارش دهی می تواند كمي یا عددی باشد که بصورت زير است.
۱) عددي
- +۱ ( کمتر از یک باکتری در هر میدان میکروسکپی روغن ايمرسيون ]×۱۰۰[)
- +۲ ( ۱ در فيلد روغن ايمرسيون)
- +۳ ( ۲ تا ۱۰ در فيلد روغن ايمرسيون)
- +۴ ( غالب يا ۱۰< در فيلد روغن ايمرسيون)
۲) توصيفي
- كمياب: کمتر از یک باکتری در فيلد روغن ايمرسيون)
- كم: (۱ تا ۵ در فيلد روغن ايمرسيون)
- متوسط: (۵ تا ۱۰ در فيلد روغن ايمرسيون)
- زياد: (۱۰< در فيلد روغن ايمرسيون)
مرفولوژي باكتري هاي مشاهده شده را ثبت كنيد.
نکات مهم در رنگ آمیزی گرم:
- حرارت بیش از اندازه هنگام تثبیت گسترش باعث پاره شدن دیواره سلولی باکتری شده . بنابراین باکتری گرم مثبت رنگ اولیه (کریستال ویوله) را هنگام رنگ بری از دست می دهد و رنگ ثانویه را جذب می نماید و در نتیجه باکتری گرم مثبت ، بصورت گرم منفی دیده می شود.
- اگر گسترش ضخیم باشد هنگام مرحله بی رنگ شدن ، ممکن است مانند یک گسترش معمولی رنگ نشود و این مسئله باعث خطا در تشخیص شما در گرم منفی یا مثبت بودن باکتری خواهد شد.
- غلظت درست و تازه بودن رنگها هم در رنگ آمیزی موثر است .
- رنگ بری بیش از حد ممکن است باعت پاره شدن جدار باکتریهای گرم مثبت شده در نتیجه این باکتریها رنگ کریستال ویوله خود را از دست داده و رنگ ثانویه را جذب می نماید و بصورت گرم منفی دیده می شود.
- دقت شود هنگام تهیه گسترش روی لام از محیط کشت ، سن کشت باکتری باید ۲۴ ساعت یا کمتر باشد . بنابراین در محیط کشتهایی که از عمر آنها گذشته و کهنه شده اند ، در قابلیت نفوذ دیواره سلولی باکتریها تغییراتی حاصل می شود که خاصیت گرم مثبت بودن را از دست می دهد
- نتايج رنگ آميزي گرم مي بايستي در تطابق با ساير يافته هاي باليني و آزمايشگاهي مورد استفاده قرار گيرد.
- براي كسب نتايج صحيح، پيروي دقيق از روش انجام آزمايش و معيارهاي تفسير الزامي مي باشد. صحت، ارتباط زيادي با آموزش و مهارت شخص مشاهده كننده اسلايد دارد.
- مشاهده ميكروارگانيزم هاي گرم مثبت و نمونه هاي كشت منفي ممكن است در نتيجه آلودگي معرف ها و ساير لوازم، حضور عوامل ضدميكروبي، يا كاهش رشد ارگانيسم ها تحت شرايط كشت معمول (محيط كشت ، اتمسفر و غيره) باشد.
- نتايج نادرست رنگ آمیزی گرم ، ممكن است مربوط به كيفيت نامناسب جمع آوري نمونه باشد.
- ممكن است گاهي واكنش رنگ آميزي گرم با كلني هاي خيلي تازه در مقايسه با كلني هاي كهنه تر متفاوت باشد. وقتي كه اسميرها از ساب كالچر ۲۴ – ۱۸ ساعته تهيه مي شوند (زماني كه سلول هاي باكتريايي در فاز لگاريتمي رشد هستند)، مرفولوژي اغلب باكتري ها در رنگ آميزي گرم، در بهترين شرايط مي باشد.
باکتری های مهم از نظر پزشکی که با رنگ آمیزی گرم قابل مشاهده نیستند:
برخی از باکتریها همانند مایکو باکتریوم توبرکلوزیس با رنگ آمیزی گرم میانه خوبی ندارند و برای تشخیص و مشاهده از روشها و رنگ آمیزی های خاصی استفاده می شود. مثلا” برای تشخیص مایکو باکتریوم توبرکلوزیس از رنگ آمیزی اختصاصی ذیل – نیلسون که یک رنگ آمیزی اختصاصی برای باکتری های مقاوم به اسید است.
| نام باکتری | علّت عدم مشاهده باکتری با روش گرم | روش رنگ آمیزی جایگزین |
| مایکو باکتریوم ها مثل مایکو باکتریوم توبرکلوزیس | وجود مقدار زیادی چربی در دیواره سلولی که از نفوذ رنگ جلوگیری می کند | رنگ امیزی اسید فاست |
| ترپونما پالیدوم | نازکتر از آن است که دیده شود | میکروسکوپ زمینه تاریک یا آنتی بادی فلوئورسنت |
| مایکوپلاسما پنومونیه | نبود دیواره سلولی | روشی وجود ندارد |
| لژیونلا پنوموفیلا | عدم دریافت رنگ قرمز | طولانی نمودن مرحله افزودن سافرانین در رنگ امیزی گرم |
| کلامیدیا ها از جمله کلامیدیا تراکوماتیس | وجود ارگانیسم های درون سلولی، کوچکی سلول | …………… |
| ریکتزیا ها | وجود ارگانیسم های درون سلولی، کوچکی سلول | رنگ آمیزی گیمسا یا سایر رنگ آمیزی های بافتی |
| جدول ۱- باکتری های مهم از نظر پزشکی که با رنگ آمیزی گرم قابل مشاهده نیستند |
ب- رنگ آمیزی گرم به روش carbol-fuchsin Basic
از این روش براي شناسايي ارگانيسم هاي گرم منفي كه رنگ كمي گرفته اند به كار مي رود.
ج- رنگ آمیزی گرم به روش Kopeloff’s modification
براي مشاهده و افتراق بهتر بي هوازيها توصيه مي شود از روش رنگ آميزيKopeloff’s modification استفاده شود.
