دسته‌بندی نشده

آزمایش کمبز مستقیم و غیر مستقیم

تست کومبس مستقیم (DAT) در سال ١٩۴۵ آقای کومبس با همکارانش گروهی از آنمی ها همولیتیک را که علتش گروهی از آنتی بادی ها بودند تشخیص دادند به همین دلیل روند این آزمایش را ” کومبس” نام گذاری کردند.
کومبس مستقیم، حساس شدن گلبولهای قرمز را در داخل گردش خون توسط آنتی بادی و یا اجزاءکمپلمان و یا هر دو را نشان می دهد.
در حالت عادی “برای مثال” rbc با چندین IgG یا اجزا کمپلمان (حدود ۴٠ تا ۵٠) آغشتگی دارد، اما زمانی کومبس + است که این اتصالات بیشتر باشد (حدود ۵٠٠).
در اثر این اتصالات، بدن واکنش می دهد مثلا ماکروفاژ با Fc رسپتور های خود به Fc آنتی بادی های متصل به rbc می چسبد و باعث تخلیه آن می شود و این تست برای تشخیص و جلوگیری از این واکنش انجام می شود.
 

موارد کاربرد

١. تشخیص آنمی اتوایمیون یا hemolytic anemia ناشی از تولید اتو انتی بادی علیه گلبول های قرمز خودی است.
٢. بیماری های همولیتیکی نوزادان یا erythroblastosis fetalis که به علت ناسازگاری خونی خصوصا Rh بین مادر و جنین است.
٣. کم خونی همولیتیک متعاقب مصرف برخی از داروها
۴. کم خونی همولیتیک در نتیجه آلو آنتی بادی های ناشی از تزریق خون که اخیراً به بیمار صورت گرفته است .
۵. هموگلوبینوری حمله ای سرد (PCH)
از این تست برای شناسایی آنتی‏بادیهای ناقص ـ که بر روی RBC نشسته و آنها را حساس کرده است استفاده می‏شود. این تست به دو روش مستقیم و غیرمستقیم انجام می‏شود. اساس این تست بر ایجاد شبکه بین آنتی‏بادیهای ناقص در سطح گلبولهای قرمز حساس شده (توسط AHG) برای ایجاد آگلوتیناسیون می‏باشد. این تست در دو مرحله کلی انجام می‏شود:
۱. مرحله حساس شدن
 
۲. اضافه کردن معرف کومبز

کومبز مستقیم

از کومبز مستقیم برای شناسایی آنتی‏بادیهای ناقص متصل به RBC جنین استفاده می‏شود. تفاوتی که بین کومبز مستقیم و غیرمستقیم وجود دارد این است که،  مرحله حساس شدن گلبولهای قرمز در بدن جنین اتفاق می‏افتد. عامل اصلی حساس شدن RBC (در ۷۵% موارد) ناسازگاری گروههای خونی RH می‏باشد هر چند که گروههای خونی ABO در ۲۵ درصد موارد هم می‏توانند باعث حساس شدن RBC شوند.

ناسازگاری RH

اگر خون جنین+Rh و خون مادر -Rh باشد آنتی‏بادیهای تولید شده از کلاس Igg در بدن مادر از جفت عبور کرده و باعث حساس شدن RBCهای جنین می‏شود.

ناسازگاری ABO

این ناسازگاری زمانی باعث حساس شدن RBC می‏شود که گروه خونی مادرO و گروه خونی جنین AB باشد در این صورت آنتی‏بادی ۳ Igg آنتی AB موجود در سرم مادر به جنین منتقل شده و باعث حساس شدن RBC جنین می‏شود.

روش انجام تست کومبز مستقیم

خون بند ناف را گرفته و از آن سوسپانسیون ۵ درصد گلبولهای قرمز تهیه می‏کنیم. چون مرحله حساس شدن RBC در بدن جنین اتفاق افتاده است بنابراین نیازی به انکوبه کردن نیست.
۰/۱ میلی‏لیتر از سوسپانسیون ۵ درصد RBC را به ۱/۰میلی لیتر AHG اضافه می‏کنیم و برای تشکیل شبکه بین RBC، لوله‏های تست را به مدت ۳ تا ۵ دقیقه در دمای آزمایشگاه نگه می‏داریم. بعد از ۵ دقیقه، لوله‏ها را در۱۰۰۰ و به مدت یک دقیقه سانتریفیوژ می‏کنیم. در آخر هم لوله‏ها را از نظر آگلوتیناسیون با زدن ضربه‏ای ضعیف به لوله، بررسی می‏کنیم.

 بررسی نتایج

اگر آگلوتیناسیون مشاهده شود، نشان دهنده حساس بودن RBC جنین است و باید تعیین تیتر شود (که در این تعیین تیتر، AHG را رقیق می کنیم نه سرم را) چون در زایمان دوم به بعد باعث HDN در نوزادان می‏شود.

کومبز غیرمستقیم

از کومبز غیرمستقیم برای شناسای RBC حساس شده در محیط In vitro استفاده می‏شود. مرحله حساس شدن RBCها در این روش توسط انکوباسیون انجام می‏شود. مراحل بعدی تقریبا مشابه کومبز مستقیم است. در این تست آنتی‏بادیهای ناقص، در خون مریض (مادر) وجود دارد. این آنتی‏بادیها به دو علت عمده ممکن است تولید شوند:
۱. انتقال خون
۲. زایمان اول
برای بررسی وجود و یا عدم وجود این آنتی‏بادی، از سوسپانسیون ۵ درصد RBC، گروه خونی +O استفاده می‏شود. چون آنتی‏بادیهای ناقص، شاخصهای آنتی‏ژن RBCهای گروه خونی +O  را حساس و با اضافه کردن AHG باعث ایجاد آگلوتیناسیون می‏شود.

علت استفاده از +O

برای اینکه ناسازگاری گروههای خونی ABO را از بین ببریم از این گروه خونی استفاده می‏کنیم چون اگر گروههای خونی A,B,AB استفاد شود، در این صورت ممکن است آنتی‏بادی ضد AB گروه خونی O باعث حساس شدن سوسپانسیون شود.
و علت اینکه از +RH استفاده می‏کنیم این است که می‏خواهیم آنتی‏بادیهای ناقص بر روی آنتی‏ژنهای +RH بشیند و بتوانیم آگلوتیناسیون را مشاهده کنیم. اگر -RH باشد در روی RBC، آنتی‏ژنی وجود نخواهد داشت تا RBC توسط آنتی‏بادی حساس شود.

روش انجام تست کومبز غیرمستقیم

۰/۱ میلیمتر از سرم بیمار را با ۱/۰ میلیمتر از سوسپانسیون ۵ درصد مخلوط می‏کنیم و سپس لوله آزمایش را به مدت ۳۰ تا ۴۰ دقیقه در انکوباتور ۳۷ درجه قرار می‏دهیم در این مرحله RBC در صورت وجود آنتی‏بادی ناقص در سرم، حساس خواهند شد. بعد از این مدت، لوله آزمایش را به مدت یک دقیقه در دور ۱۰۰۰ سانتریفیوژ می‏کنیم. و سه بار توسط سرم فیزیولوژی شستشو می‏دهیم تا آنتی‏بادیهای غیراختصاصی حذف شوند و فقط آنتی‏بادیهای اختصاصی که به شاخصهای آنتی‏ژنی RBC چسبیده‏اند، باقی بمانند. بعد از این مراحل یک قطره AHG به لوله اضافه می‏کنیم و بعد از ۳ تا ۵ دقیقه لوله را به مدت یک دقیقه در دور ۱۰۰۰ سانتریفیوژ می‏کنیم و در آخر هم با زدن ضربه‏ای ضعیف آگلوتیناسیون را بررسی می‏کینم.

بررسی نتایج

اگر آگلوتیناسیون مشاهده شود تست کومبز غیرمستقیم بیمار را مثبت گزارش می‏کنیم.

چند نکته:

۱ـ قبل از انکوبه با اضافه کردن دو قطره آلبومین می‏توان آگلوتیناسیون را بهتر بررسی کرد.
۲ـ اگر بعد از انکوبه، آگلوتیناسیون مشاهد شود نشان دهنده این نکته است که در سرم ما آنتی‏بادی کامل وجود دارد و در واقع Back Type را انجام داده‏ایم.
۳- برای بررسی آگلوتیناسیون بهتر است از میکروسکوپ استفاده کنیم.

روش تهیه سوسپاسیون ۵ درصد

۲ قطره خون داخل لوله آزمایش می‏ریزیم. ۳ میلی‏لیتر سرم فیزیولوژی به لوله اضافه می‏کنیم و در سانتریفیوژ در دور ۳۰۰۰ به مدت ۵ دقیقه قرار می‏دهیم سپس مایع رویی را خالی کرده و این کار را تا ۳ بار تکرار می‏کنیم.

برچسب ها

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

بستن